超氧陰離子檢測(cè)試劑盒微量法檢測(cè)說(shuō)明書(shū)

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

生物體內(nèi)超氧陰離子等活性氧具有免疫和信號(hào)傳導(dǎo)的作用，但積累過(guò)多時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞膜及生物大分子產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞和組織代謝異常，從而引起多種疾病。

測(cè)定原理：

超氧陰離子與鹽酸羥胺反應(yīng)生成 NO₂^－，NO₂^－在對(duì)氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成紅色的偶氮化合物，在530nm處有特征吸收峰，根據(jù)A₅₃₀值可以計(jì)算樣品中O₂^－含量，反應(yīng)式為 NH₂OH +2O₂^－＋H^＋→ NO₂^－＋H₂O₂＋H₂O。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、水浴鍋、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、氯仿和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 8mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 6mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體 6mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑四：氯仿，自備。

超氧陰離子檢測(cè)試劑盒提取

1. 植物、動(dòng)物組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后，10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后 10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清或培養(yǎng)液：直接測(cè)定。

測(cè)定操作表

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至530nm。

2、操作表

超氧陰離子含量計(jì)算公式

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

超氧陰離子檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0115x-0.0038，R²=0.9986

1. 組織：

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

超氧陰離子含量（μmol/g）= (A₅₃₀ +0.0038)÷0.0115×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)×10^-3×2= 1.74×(A₅₃₀ +0.0038)÷W

超氧陰離子產(chǎn)生速率（μmol/ g·min）=1.74×(A₅₃₀ +0.0038)÷W÷T

=0.087×(A₅₃₀ +0.0038)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

超氧陰離子含量（μmol/mg prot）= (A₅₃₀ +0.0038)÷0.0115×V 反總÷(V 樣×Cpr)×10^-3×2=1.74×(A₅₃₀ +0.0038)÷Cpr

超氧陰離子產(chǎn)生速率（μmol/ mg prot·min）=1.74×(A₅₃₀ +0.0038)÷Cpr÷T

= 0.087×(A₅₃₀ +0.0038)÷Cpr

2. 細(xì)菌，真菌：

超氧陰離子含量（µmol/10⁴cell）= (A₅₃₀ +0.0038)÷0.0115×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)×10^-3×2= 1.74×(A₅₃₀ +0.0038)÷細(xì)胞數(shù)量

超氧陰離子產(chǎn)生速率（µmol/mg prot·min）= 1.74×(A₅₃₀ +0.0038)÷細(xì)胞數(shù)量÷T

= 0.087×(A₅₃₀ +0.0038)÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清或培養(yǎng)液

超氧陰離子含量（μmol/L）= (A₅₃₀ +0.0038)÷0.0115 ×V反總÷V 樣×2

= 1739.13×(A₅₃₀ +0.0038)

超氧陰離子產(chǎn)生速率（μmol/L·min）= 1739.13×(A₅₃₀ +0.0038) ÷T= 86.96×(A₅₃₀ +0.0038)

V 樣總：加入提取液體積，1 mL； V 反總：反應(yīng)總體積，0.4mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.04mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；2: 2分子O₂^－參與反應(yīng)生成1分子 NO₂^－。

b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.00575x-0.0038，R²=0.9986

1. 組織：

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

超氧陰離子含量（μmol/g）= (A₅₃₀+0.0038)÷0.00575×V反總÷(V樣÷V樣總×W)×10^-3×2= 3.48×(A₅₃₀+0.0038)÷W

超氧陰離子產(chǎn)生速率（μmol/g·min）=3.48×(A₅₃₀ +0.0038)÷W÷T

=0.174×(A₅₃₀+0.0038)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

超氧陰離子含量（μmol/mg prot）= (A₅₃₀ +0.0038)÷0.00575×V反總÷(V樣×Cpr)×10^-3×2= 3.48×(A₅₃₀+0.0038)÷Cpr

超氧陰離子產(chǎn)生速率（μmol/mg prot·min）= 3.48×(A₅₃₀+0.0038)÷Cpr÷T

=0.174×(A₅₃₀+0.0038)÷Cpr

2. 細(xì)菌，真菌：

超氧陰離子含量（µmol/10⁴cell）= (A₅₃₀+0.0038)÷0.00575×V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)×10^-3×2= 3.48×(A₅₃₀+0.0038)÷細(xì)胞數(shù)量

超氧陰離子產(chǎn)生速率（µmol/10⁴cell·min）= 1.74×(A₅₃₀+0.0038)÷細(xì)胞數(shù)量÷T

=0.174×(A₅₃₀ +0.0038)÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清或培養(yǎng)液

超氧陰離子含量（μmol/L）= (A₅₃₀+0.0038)÷0.00575 ×V 反總÷V 樣×2

= 3478.26×(A₅₃₀+0.0038)

超氧陰離子產(chǎn)生速率（μmol/L·min）= 3478.26×(A₅₃₀+0.0038) ÷T

= 173.91×(A₅₃₀ +0.0038)

超氧陰離子檢測(cè)試劑盒V 樣總：加入提取液體積，1 mL； V 反總：反應(yīng)總體積，0.4mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.04mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；2：2分子O₂^－參與反應(yīng)生成1分子NO₂^－。

注意事項(xiàng)

1、 OD 值大于 1.5，樣品適當(dāng)稀釋再測(cè)定，注意計(jì)算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2、 樣品制備好后，立刻進(jìn)行測(cè)定，請(qǐng)勿將樣品進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的低溫保存，以免影響測(cè)定結(jié)果。

3、 試劑四有一定的毒性，請(qǐng)操作時(shí)做好防護(hù)措施。

4、 檢出限為 0.33µmol/L。