ADH 是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換，在很多生理過(guò)程中起著重要作用。哺乳動(dòng)物 ADH 主要在肝臟生成，肝臟損傷導(dǎo)致 ADH 釋放到血清中。血清 ADH 活性高低反映了肝功能是否異常。

測(cè)定原理：

ADH 催化 NADH 還原乙醛生成乙醇和 NAD+，NADH 在 340nm 處有吸收峰，而 NAD+沒(méi)有；測(cè)定340nm 吸光度下降速率，來(lái)計(jì)算 ADH 活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，室溫保存。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。臨用前把試劑三轉(zhuǎn)移到試劑二中，4℃保存。試劑三：粉劑×1 支，－20℃保存。

試劑四：液體×1 支，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心 20min，取上清置冰上待測(cè)。

2、 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；16000g， 4℃離心 20min，取上清液置冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

乙醇脫氫酶（ADH）檢測(cè)試劑盒ADH 測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在 25℃水浴中保溫 30 min。

3. 空白管：在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μ L 蒸餾水、160μ L 試劑二和 20μ L 試劑四，迅速混勻后于 340nm 測(cè)定吸光值變化，分別記錄 15s 和 75s 時(shí)吸光值，分別記為 A1 和 A2?！鰽 空白管=A1-A2。

4. 測(cè)定管：在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μ L 上清液、160μ L 試劑二和 20μ L 試劑四，迅速混勻后于 340nm 測(cè)定吸光值變化，分別記錄 15s 和 75s 時(shí)吸光值，分別記為 A3 和 A4?！鰽 測(cè)定管=A3-A4。

注意：空白管只需測(cè)定一次。

計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1μ mol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (μ mol/min/mg prot) =[(△A 測(cè)定管–△A 空白管)÷ε  ÷d×V 反總×106] ÷(Cpr×V 樣)÷T

=1.61×(△A 測(cè)定管–△A 空白管) ÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化 1μ mol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (μ mol/min/g 鮮重) =[(△A 測(cè)定管–△A 空白管)÷ε  ÷d×V 反總×106] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=1.61×(△A 測(cè)定管–△A 空白管) ÷W

（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1μ mol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (μ mol/min/104cell) = [(△A 測(cè)定管–△A 空白管)÷ε  ÷d×V 反總×106] ÷(細(xì)胞數(shù)量

×V 樣÷V 樣總)÷T

=1.61×(△A 測(cè)定管–△A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

（4） 按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化 1μ mol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (μ mol/min/mL) = [(△A 測(cè)定管–△A 空白管)÷ε ÷d×V 反總×106] ÷V 樣÷T

=1.61×(△A 測(cè)定管–△A 空白管)

ε ：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，200μ L=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μ L=0.02 mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

乙醇脫氫酶（ADH）檢測(cè)試劑盒b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1μ mol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (μ mol/min/mg prot) =[(△A 測(cè)定管–△A 空白管)÷ε  ÷d×V 反總×106] ÷(Cpr×V 樣)÷T

=1.61×(△A 測(cè)定管–△A 空白管) ÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化 1μ mol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (μ mol/min/g 鮮重) =[(△A 測(cè)定管–△A 空白管)÷ε  ÷d×V 反總×106] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=1.61×(△A 測(cè)定管–△A 空白管) ÷W

（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1μ mol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (μ mol/min/104cell) = [(△A 測(cè)定管–△A 空白管)÷ε  ÷d×V 反總×106] ÷(細(xì)胞數(shù)量

×V 樣÷V 樣總)÷T

=1.61×(△A 測(cè)定管–△A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

（4） 按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化 1μ mol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (μ mol/min/mL) = [(△A 測(cè)定管–△A 空白管)÷ε ÷d×V 反總×106] ÷V 樣÷T