谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B使用說(shuō)明書由上海遠(yuǎn)慕生物詳細(xì)介紹，本司現(xiàn)貨供應(yīng)ELISA試劑盒，標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品，動(dòng)物血清，培養(yǎng)基，抗體，細(xì)胞株，瓊脂糖凝膠，葡聚糖凝膠，多肽，酶類，碳水化合物，生物分子，微生物，生化試劑，化學(xué)試劑，實(shí)驗(yàn)耗材，染色液，其他試劑等，歡迎訂購(gòu)！

【谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B參數(shù)說(shuō)明】

中文名：谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B

英文名：Glutathione Sepharose 4B 

供應(yīng)商：上海遠(yuǎn)慕

規(guī)格：10ml、50ml

操作溫度：4-40℃

結(jié)構(gòu)成分：4%交聯(lián)瓊脂糖

配基偶聯(lián)量：40μmol phenyl/ml 凝膠

保存條件：4℃

性狀：白色微球，凝膠狀，保存在20%酒精溶液中

應(yīng)用：疏水層析介質(zhì)，適合含芳香族配體蛋白純化，特別適合單抗的純化等

谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B使用說(shuō)明

【谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B使用方法】　

谷胱甘肽樹(shù)脂的處理：

1、輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹(shù)脂的容器，將樹(shù)脂混成勻漿。

2、取部分勻漿放入15mL聚丙烯管(每100mL細(xì)菌培養(yǎng)物大約需要2mL勻漿)。

3、4℃500g離心5分鐘，小心去掉上清。

4、在樹(shù)脂中加入10倍柱床體積預(yù)冷的PBS，顛倒數(shù)次混勻，4℃500g離心5分鐘，小心去掉上清。

5、每毫升樹(shù)脂加入1毫升冷的PBS，制成50%勻漿，顛倒數(shù)次，混合均勻，懸液冰上放置待用。

制備細(xì)胞抽提物：

1、每100毫升培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重懸于4mLPBS緩沖液中。

2、加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL,冰上放置30分鐘。

3、用針筒將10mL濃度為0.2%的TritonX-*行注入黏稠的細(xì)胞裂解物中，劇烈振動(dòng)數(shù)次混勻；加入DNase和RNase至終濃度5ug/mL,4℃振動(dòng)溫育10分鐘，4℃3000g離心30分鐘，去除不溶性細(xì)胞碎片，上清轉(zhuǎn)移到一只新管中，加入DTT至終濃度1mmol/L。

純化融合蛋白：

1、細(xì)胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹(shù)脂勻漿混和，每100毫升細(xì)菌培養(yǎng)物加2mL樹(shù)脂，于室溫輕搖30min。

2、混合物于4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

3、沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒離心管數(shù)次混勻，洗去未與樹(shù)脂結(jié)合的蛋白。

4、4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

5、重復(fù)步驟11和12兩次。

6、結(jié)合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫，也可用凝血酶、腸激酶或Xa因子切割，釋放靶蛋白。用谷胱甘肽洗脫融合蛋白：

7、沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動(dòng)10min，洗脫樹(shù)脂小心去掉上清。

8、每毫升樹(shù)脂加入1毫升冷的PBS，制成50%勻漿，顛倒數(shù)次，混合均勻，懸液冰上放置待用。制備細(xì)胞抽提物：

9、每100毫升培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重懸于4mLPBS緩沖液中。7.加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL,冰上放置30分鐘。

10、用針筒將10mL濃度為0.2%的TritonX-*行注入黏稠的細(xì)胞裂解物中，劇烈振動(dòng)數(shù)次混勻。加入DNase和RNase至終濃度5ug/mL,4℃振動(dòng)溫育10分鐘，4℃3000g離心30分鐘，去除不溶性細(xì)胞碎片，上清轉(zhuǎn)移到一只新管中，加入DTT至終濃度1mmol/L。

純化融合蛋白：

1、細(xì)胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹(shù)脂勻漿混和，每100毫升細(xì)菌培養(yǎng)物加2mL樹(shù)脂，于室溫輕搖30min。

2、混合物于4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

3、沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒離心管數(shù)次混勻，洗去未與樹(shù)脂結(jié)合的蛋白。

4、4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

5、重復(fù)步驟11和12兩次。

6、結(jié)合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫，也可用凝血酶、腸激酶或Xa因子切割，釋放靶蛋白。

用谷胱甘肽洗脫融合蛋白：　

1、沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動(dòng)10min，洗脫樹(shù)脂上結(jié)合的蛋白。

2、4℃以500g離心5分鐘，上清(含洗脫的融合蛋白)移至新管中。

3、重復(fù)步驟a和b兩次，合并3次上清。蛋白酶解從結(jié)合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：

4、在結(jié)合了融合蛋白的樹(shù)脂中加入凝血酶、腸激酶或Xa因子(根據(jù)融合蛋白中的位點(diǎn)選擇)，每mL樹(shù)脂加入50單位溶于1mLPBS的蛋白酶。顛倒離心管數(shù)次混勻，室溫下振蕩2—16小時(shí)。用小規(guī)模實(shí)驗(yàn)確定時(shí)間。19.4℃以500g離心5分鐘，上清小心移至新管中。(GST仍結(jié)合在樹(shù)脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中，仍需要分離)20.10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質(zhì)組成。

試劑配制：

谷胱甘肽洗脫緩沖液：10mmol/L還原型谷胱甘肽，50mmol/LTris-Cl(pH8.0)

相關(guān)試劑：

PMSF(100mM)

溶菌酶(100mg/mL)

IPTG溶液(50mg/mL)

1MTris-HCl(PH=8.0)

SDS-PAGE凝膠制備試劑盒

His標(biāo)簽純化樹(shù)脂(Ni-NTAResin)

預(yù)染低分子量蛋白MARKER

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒

【谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B說(shuō)明】

pGEX載體表達(dá)的外源蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合，因此可以通過(guò)谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化。GSTs是一類以谷胱甘肽(γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸)作為底物，通過(guò)形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST對(duì)底物的親和力是亞毫摩爾級(jí)的，因此谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹(shù)脂對(duì)GST及其融合蛋白的純化效率很高。可以用含游離谷胱甘肽的緩沖液洗脫結(jié)合GST融合蛋白；樹(shù)脂用3mol/LNaCl的緩沖液再生；谷胱甘肽瓊脂糖對(duì)GST融合蛋白的結(jié)合能力很強(qiáng)(每毫升柱床體積的樹(shù)脂能結(jié)合8毫克融合蛋白)。

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