(一)雜交瘤陽(yáng)性克隆的篩選

    并非所有的雜交瘤細(xì)胞都能分泌針對(duì)目的抗原的特異性McAb，因此必須通過可靠、簡(jiǎn)便、快速的方法進(jìn)行篩選和克隆化。雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測(cè)。具體方法依抗原性質(zhì)及抗體類型而定。常用的方法有ELISA法、間接血凝試驗(yàn)、放射免疫測(cè)定、直接和間接熒光抗體技術(shù)、免疫酶斑點(diǎn)試驗(yàn)等。

(二)克隆化技術(shù)

    為確保McAb的純一性及避免其他陰性細(xì)胞對(duì)其生長(zhǎng)的影響，要將陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分離培養(yǎng)，產(chǎn)生單克隆雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)2～3次檢測(cè)均為陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞，應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。常用方法包括有限稀釋法(limiting dilution，LD)、軟瓊脂法、直接挑取法及熒光激活細(xì)胞分離儀(FACS)分離法。以LD法zui為常用，效果好、簡(jiǎn)便。LD法：將細(xì)胞再懸浮，收集并計(jì)數(shù)。按105、104、103、102、101的濃度用RPMI 1640培養(yǎng)液做系列稀釋。取一塊96孔培養(yǎng)板，預(yù)先按每孔 lO3～lO6／10ml*培養(yǎng)液加好飼養(yǎng)細(xì)胞，然后加入8～10／ml的低濃度細(xì)胞懸液，每孔lOOpl，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7～lOd，其間盡量少觀察。之后，選擇單克隆生長(zhǎng)的陽(yáng)性孔再一次進(jìn)行克隆。一般需要如此反復(fù)3～5次，直至達(dá)lOO％陽(yáng)性iL時(shí)即可。

一、雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

(一)雜交瘤細(xì)胞的凍存

    及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞和每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的，因?yàn)樵跊]有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞污染、分泌抗體能力喪失等現(xiàn)象。細(xì)胞凍存的原理是細(xì)胞在加血清和二甲基亞砜的培養(yǎng)基中以一定的緩慢速度下降溫度(O℃～一20℃，下降1℃／min；一20℃～一40℃下降2℃／min)，可在一196℃液氮或液氮蒸氣中長(zhǎng)期保存。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。每種細(xì)胞株至少凍存5～10管。

(二)雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇

    將雜交瘤細(xì)胞的凍存管從液氮罐里取出，立即投入37℃水浴中，待細(xì)胞懸液快速解凍后，立即將細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液清洗2次，然后用RPMI 1640*培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液滴人24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶中，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)，2～3d傳代培養(yǎng)。若冷凍后細(xì)胞死亡較多，可加入飼養(yǎng)細(xì)胞共同培養(yǎng)，在復(fù)蘇冷凍細(xì)胞前1d，于24孔培養(yǎng)板上每孔加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞0．5ml(104／ml)。應(yīng)定期進(jìn)行復(fù)蘇，以檢查雜交瘤細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，傳代后再凍存。