腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是一類能引起腫瘤組織出血壞死的細(xì)胞因子。TNF可對一些腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系起殺傷作用。根據(jù)這一特點(diǎn)，可利用對TNF敏感的靶細(xì)胞測定TNF活性。常用的方法有細(xì)胞毒性法和免疫學(xué)檢測法。

(一)細(xì)胞毒性法

    該方法是檢測TNF對小鼠成纖維細(xì)胞株L929或L—M細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，細(xì)胞死亡率與TNF活性成正比。用染色法、同位素測定法。

1．染色法

(1)原理：TNF對L929細(xì)胞有細(xì)胞毒作用。利用染料中性紅、結(jié)晶紫或MTT可使活細(xì)胞染色，再用脫色液將染料脫出，測定其OD值，即可反應(yīng)細(xì)胞的存活狀態(tài)或TNF對L929細(xì)胞的殺傷率，通過計(jì)算細(xì)胞死亡率，并與TNF標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可檢測待測樣品TNF活性單位。

(2)材料

1)待測樣品：10% FCS RPMI 1640作倍比稀釋至少6個(gè)不同稀釋度。

2)TNF標(biāo)準(zhǔn)品。

3)L929細(xì)胞株。

4)10％FCS RPMI 1640培養(yǎng)液。

5)0．25％結(jié)晶紫(溶于20％甲醇中)。

6)枸櫞酸鈉緩沖液(O．9％枸櫞酸鈉，0．02 mol／L鹽酸，47．5％乙醇)。

7)96孔培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀。

(3)方法

1)在96孔培養(yǎng)板各孔中加 lOO μl含2×lO5／ml細(xì)胞懸液，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)2～3 h，讓細(xì)胞貼壁。

2)用RPMI 1640培養(yǎng)液10倍依次稀釋TNF標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)需要3～5倍依次稀釋待檢樣品，每孔加100μl稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣品，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)孔。對照孔6個(gè)，3個(gè)酊性對照孔各加100 μl含4 μg TNF的RPMI 1640培養(yǎng)液，3個(gè)陰性對照孔各加100 μl RP—MI 1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)18~24 h。

3)甩去培養(yǎng)液，用PBS小心洗滌一次，每孔加100 μl 10%甲醇溶液固定細(xì)胞30 s。

4)吸去甲醇溶液，每孔加100 μl結(jié)晶紫染液，室溫中放置20 min。

5)輕輕甩去染色液，用生理鹽水洗滌各孔，將培養(yǎng)板倒置于吸水紙上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。

6)測定前，每孔加100 μl 33％脫色液，充分振蕩后在570 nm處測定吸光度。

(4)結(jié)果分析用光吸收度(OD)值對樣品稀釋度作圖，比較標(biāo)準(zhǔn)品曲線和待檢樣品曲線即可得到待測樣品中的細(xì)胞因子活性。

2．同位素法

(1)原理：TNF’對L929細(xì)胞有細(xì)胞毒作用。若這種細(xì)胞先用。H-TdR標(biāo)記，則被殺傷后3 H—TdR釋放至細(xì)胞外，因此可以通過測定腫瘤細(xì)胞釋放3 H-TdR的量來反映TNF的殺傷活性。

(2)材料

1)待測樣品：10％FCS．RPMI 1640作倍比稀釋至少6個(gè)不同稀釋度。

2)TNF標(biāo)準(zhǔn)品。

3)L929細(xì)胞。

4)10％FCS RPMI 1640。

5)3 H—TdR(O．5 μci／50μl)。

6)放線菌素D(1μg／ml)

7)閃爍液。

8)9999型玻璃纖維濾紙。

9)細(xì)胞收集儀。

10)β液閃計(jì)數(shù)儀。

(3)方法

1)取對數(shù)生長期的L929細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×lO6／ml。

2)加入3 H—TdR O．5μci，置37℃、5％C02孵箱中培養(yǎng)2～3 h，搖動(dòng)30 min／次。

3)用RPMI 1640洗滌2次，每次800 r／min，離心5 min。

4)調(diào)整細(xì)胞濃度至2～3×105／ml后，加入96孔培養(yǎng)板中，100μl／孔。

5)加入不同稀釋度的待測樣本及標(biāo)準(zhǔn)品(設(shè)三個(gè)重復(fù)孔)，加入放線菌素D，使放線菌素Dzui終濃度至lμg／ml，用時(shí)設(shè)放線菌素、*培養(yǎng)基陰性對照和TNF標(biāo)準(zhǔn)品陽性對照37℃、5％C02孵箱中培養(yǎng)24 h。

6)加入3％胰蛋白酶和0．25％DNA酶各10μl／孔，用多頭細(xì)胞收集器收集樣品于9999型玻璃纖維濾紙上，烤干后，進(jìn)行β計(jì)數(shù)。