透析法

    熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可將未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。

（1）將標(biāo)記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，液面稍留空隙，緊扎。抗體

（2）浸入0.02mol/pH。

    7.1~7.4的PBS中（懸于大于標(biāo)記物體積約50~100倍的PBS內(nèi)），在4℃中透析，每日更換3~4次PBS，約5~7天，透析液中無(wú)熒即可（在熒光光源照射下）。

葡聚糖凝膠G-50柱層析法

    除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細(xì)方法參閱第二章。加入熒光抗體15~18ml（按床體積的5%~10%加樣），使其緩慢滲入柱內(nèi)，待即將全部入柱時(shí)，加入PBS少許，關(guān)閉下口，停留30~40min ，使游離熒光充分進(jìn)入細(xì)篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來(lái)越大，熒光抗體zui先流出，分前、中、后三部分收集，測(cè)F/P比值，合格者合并，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測(cè)定蛋白（發(fā)生沉淀反應(yīng)），繼續(xù)洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來(lái)，至洗脫液中無(wú)蛋白和熒光素后，此層析柱即可再用。

    若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，太濃NH4+，在蛋白未*洗脫時(shí)即出現(xiàn)NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現(xiàn)蛋白時(shí)，即進(jìn)行收集，之后出現(xiàn)SO4++（用1%BaCl2檢查發(fā)生白色沉淀）。zui后是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀），待洗脫液無(wú)SO4++及NH4+后可再用。

    如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2~3.5ml熒光抗體。