1、切片固定后用毛細滴管吸取經(jīng)適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。

2、再滴加間接熒光抗體（如兔抗人 -球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。

對照染色：①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。②抗原對照：即類屬抗原染色，亦應(yīng)為陰性。③陽性對照。

間接法中上述方法稱雙層法（Double Layer Method）。另一種稱夾心法，即用未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應(yīng)抗體結(jié)合，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下：

①切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。

②滴加未標記的特異性抗原作用切片于37℃，30min。

③緩沖鹽水洗2次，每次5min，吹干。

④滴加特異性熒光抗體再用切片于37℃，30min。

⑤如③水洗。

⑥緩沖甘油封固，鏡檢。