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雙熒光素酶報(bào)告基因測試

時(shí)間:2012-10-15閱讀:1674
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            雙報(bào)告基因用于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測,通常一個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)對照,使另一個(gè)報(bào)告基因的檢測均一化。檢測基因表達(dá)時(shí)雙報(bào)告基因通常用來瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞,帶有實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的載體共轉(zhuǎn)染帶有不同的報(bào)告基因作為對照的第二個(gè)載體。通常實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動子,研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報(bào)告基因表達(dá)活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān),偶聯(lián)到組成型啟動子的第二個(gè)報(bào)告基因,提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照, 使測試不被實(shí)驗(yàn)條件變化所干擾。通過這種方法,可減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性,比如,培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別,細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率。

              使用螢火蟲熒光素酶,結(jié)合氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT),β-半乳糖苷酶(β-Gal),或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的雙報(bào)告基因,近幾年已普遍使用。但這些雙報(bào)告基因組合削弱了熒光 素酶操作的優(yōu)勢 , 比如熒光素酶測試和定量可在幾秒鐘內(nèi)進(jìn)行, 但CAT,β-Gal和GUS測試法,則在定量前需要長時(shí)間的保溫。另外,這些報(bào)告基因受限于它們的靈敏度和線性應(yīng)答范圍,必須注意不要超過這些范圍,內(nèi)源性細(xì)胞活力也會干擾這類報(bào)告基因的使用。許多類型的細(xì)胞有內(nèi)源β-Gal或GUS表達(dá),不利于準(zhǔn)確定量報(bào)告基因表達(dá),胞內(nèi)去乙酰酶活力干擾CAT活力測試。盡管在高溫下預(yù)處理細(xì)胞裂解液,會降低內(nèi)源性β-Gal和CAT測試的干擾,但這些處理也會快速失活熒光素酶。因此,在此類雙報(bào)告基因檢測中, 必須以不同的步驟分別處理共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解液。

           理想的雙報(bào)告基因方法應(yīng)該使用戶能夠以螢火蟲熒光素酶所具有的速度,靈敏和線性范圍對同一樣品中的兩個(gè)報(bào)告基因同時(shí)測定。這在傳統(tǒng)的報(bào)告基因,如CAT,β-Gal和GUS是不可能的,由于它們測試化學(xué),處理要求所固有的局限。相反,結(jié)合螢火蟲 ( Photinus pyralis )和海洋腔腸 ( Renilla reniformis ) 雙熒光素酶,Promega 的雙熒光素酶報(bào)告基因測試 (DLR)系統(tǒng)可滿足這些要求,在單管中完成這些測試。

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