生命體是一個(gè)多層次，多功能的復(fù)雜結(jié)構(gòu)體系，轉(zhuǎn)錄組代表了基因表達(dá)的中間狀態(tài)。基因功能的多組學(xué)分析過(guò)程中，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)憑借其低廉的試驗(yàn)成本，被廣泛應(yīng)用于重要功能基因表達(dá)差異的驗(yàn)證。研究人員僅需下載GenBank中目的基因的參照mRNA序列，設(shè)計(jì)、合成一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物和一對(duì)適宜的看家基因擴(kuò)增引物，抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，通過(guò)比較試驗(yàn)組和對(duì)照組間基因表達(dá)的差異，就能確定試驗(yàn)處理對(duì)功能基因表達(dá)的影響。但是貌似非常成熟的試驗(yàn)體系真的能揭示特定功能基因轉(zhuǎn)錄組水平表達(dá)的真相嗎？研究人員是否遺漏了某些可能影響其研究結(jié)論的生物學(xué)事件？

可變剪接（alternative splicing，AS，又稱選擇性剪接，是真核生物基因表達(dá)的普遍調(diào)節(jié)機(jī)制, 指功能基因通過(guò)不同剪接，從一個(gè)mRNA前體（選擇不同的剪接位點(diǎn)組合）產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過(guò)程?？勺兗艚涌僧a(chǎn)生在非翻譯區(qū)（UTR）或編碼序列，其機(jī)制包括: 外顯子跳躍（exon skip，ES）、內(nèi)含子保留（retained intron，RI）、可變供體位點(diǎn)（Alternate Donor site，AD）、可變受體位點(diǎn)（Alternate acceptor site，AA）、可變啟動(dòng)子（Alternate promoter，AP）、可變終止子（Alternate terminator，AT）和外顯子互斥（Mutually exclusive exons, ME）這七類。mRNA通過(guò)這七類可變剪接，對(duì)mRNA的穩(wěn)定性、定位或翻譯進(jìn)行調(diào)控[1]。90％~95％的人類基因會(huì)經(jīng)歷選擇性剪接[2,3]。20,000種人類蛋白質(zhì)編碼基因中有1/3以上的基因通過(guò)可變剪接產(chǎn)生多個(gè)蛋白亞型[4]。除了涉及器官發(fā)育，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞類型特異性功能[5、6]外，可變剪接還與癌癥[7]、藥物靶點(diǎn)[8]等病理過(guò)程有關(guān)。

以磷酸酶和肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)因子1（PHACTR1）為例，2009年該基因就被確定與人冠狀動(dòng)脈疾?。–AD）有關(guān)[9]。借助RACE和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，Valérie-Anne等（2018）確定該基因存在6種蛋白亞型，包括單核細(xì)胞表達(dá)435 bp的短轉(zhuǎn)錄本（144 aa），大腦表達(dá)1743 bp的長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本（580 aa），和外顯子7、8或10、11可變剪接產(chǎn)生的A+(1953bp，650 aa)、B+(1674 bp，557 aa)、A-(1746 bp，581 aa)、B- (1467 bp，488 aa)4種適中長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)錄本。除短轉(zhuǎn)錄本與人免疫功能有關(guān)外，長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮或血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的4種適中長(zhǎng)度轉(zhuǎn)錄本均涉及CAD。PHACTR1內(nèi)含子的rs9349379位點(diǎn)可破壞MEF2的結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)A+、B+的表達(dá)，zui終影響CAD[10]。

另外，馬的COBLL1基因存在COBLL1a和外顯子9缺失的COBLL1b這兩種可變剪接。COBLL1b缺失的外顯子9編碼40個(gè)氨基酸殘基，包含了酪蛋白激酶1、p38絲裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)，這些磷酸化位點(diǎn)與蛋白的穩(wěn)定性密切相關(guān)。通過(guò)比較sai馬多個(gè)組織的COBLL1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，多個(gè)組織的COBLL1b表達(dá)較為穩(wěn)定；腎臟、脊髓、肺中COBLL1a的表達(dá)量zui高，甲狀腺和結(jié)腸中表達(dá)zui低；純種馬運(yùn)動(dòng)后肌肉組織COBLL1a和COBLL1b的表達(dá)均發(fā)生下調(diào)。因此，COBLL1基因僅通過(guò)外顯子9的有無(wú)就實(shí)現(xiàn)了同一基因在不同組織表達(dá)模式的精細(xì)調(diào)控，并zui終影響賽ma運(yùn)動(dòng)后的肌肉葡萄糖水平的調(diào)節(jié)或能量來(lái)源轉(zhuǎn)換過(guò)程[11]。

以上兩個(gè)例子都說(shuō)明了，通過(guò)可變剪接，同一基因可發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。如果不了解目的基因的可變剪接情況，科研人員通過(guò)直接下載GanBank登錄的參照基因mRNA序列，就設(shè)計(jì)功能基因的定量檢測(cè)引物，來(lái)檢測(cè)基因的表達(dá)情況，獲得的很可能是不全面，甚至錯(cuò)誤的信息。

對(duì)功能基因表達(dá)的正確分析，首先建立在研究人員對(duì)目的基因可變剪接的全面認(rèn)識(shí)之上。首先，研究人員應(yīng)該通過(guò)RACE技術(shù)或三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，明確目的基因是否存在可變剪接。如果證實(shí)目的基因存在多種可變剪接后，應(yīng)對(duì)不同可變剪接的序列進(jìn)行比對(duì)和生物信息學(xué)分析，確認(rèn)可變剪接的類型和不同可變剪接的特征區(qū)域，針對(duì)相應(yīng)特征區(qū)域設(shè)計(jì)定量的檢測(cè)引物，才能正確獲取功能基因的表達(dá)情況。