艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒背景：

半胱天冬酶不能切割FLICA抑制劑探針；相反它與靶上的FMK形成不可逆的共價(jià)鍵

并被抑制進(jìn)一步的酶活性。信息和通信技術(shù)聚半胱天冬酶FLICA探針FAM-VAD-FMK可作為一種通用的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的試劑，因?yàn)樗辉S多類型的激活的胱天蛋白酶。更具體地靶向特定的胱天蛋白酶酶，使用ICT的專用FLICA試劑之一。ICT有套件用于檢測(cè)：caspase-1（YVAD或WEHD）（也可識(shí)別Caspases 4和5）、-2（VDVAD）、-3/7（DEVD）、-6（VEID）、-8（LETD）、-9（LEHD）和-10（AEVD）。FLICA套件也有紅色或遠(yuǎn)紅色熒光標(biāo)記。Caspases，像大多數(shù)其他關(guān)鍵細(xì)胞一樣存活酶在目標(biāo)氨基酸中有一定的容許性它們將識(shí)別并切割的序列。盡管FLICA試劑含有各自優(yōu)選的不同氨基酸靶序列caspase，它們也可以識(shí)別其他活性caspase

存在。

FLICA可用于標(biāo)記懸浮或粘附細(xì)胞組織切片。用FAM-FLICA標(biāo)記后，細(xì)胞可以固定或

凍結(jié)的對(duì)于標(biāo)記后將被石蠟包埋的組織，使用ICT紅色硫羅丹明SR-FLICA探針；不要使用綠色FAM-FLICA探針作為FAM染料將在石蠟包埋過程中淬滅。用FAM-FLICA標(biāo)記的細(xì)胞可以用試劑進(jìn)行反染色例如紅色活/死染色物碘化丙啶（包括在FAMFLICA試劑盒中）和7-AAD（目錄#6163）壞死。核形態(tài)可以同時(shí)使用Hoechst 33342，一種藍(lán)色DNA結(jié)合染料（包括在FLICA試劑盒中）。細(xì)胞可以通過熒光顯微鏡直接觀察，或者熒光強(qiáng)度可以被量化使用流式細(xì)胞儀或熒光平板讀取器（圖8）。FAM-FLICA最佳激發(fā)波長(zhǎng)為488-492nm峰值發(fā)射在515-535nm。  

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒組分：

試驗(yàn)尺寸套件包含：

•1瓶FAM-FLICA胱天蛋白酶抑制劑試劑

•1瓶10X凋亡洗滌緩沖液（15 mL），#635

•1瓶固定劑（6 mL），#636

•1小瓶碘丙啶，250µg/mL（1 mL），#638

•1小瓶Hoechst 33342，200µg/mL（1 mL），#639

標(biāo)準(zhǔn)尺寸套件包含：

•4瓶FAM-FLICA胱天蛋白酶抑制劑試劑

•1瓶10X凋亡洗滌緩沖液（60 mL），#634

•1瓶固定劑（6 mL），#636

•1小瓶碘丙啶，250µg/mL（1 mL），#638

•1小瓶Hoechst 33342，200µg/mL（1 mL），#639。

將未開封的套件和每個(gè)未開封的組件儲(chǔ)存在2-8°C，直到到期日期。一旦用DMSO重新配制，立即使用FLICA，或在≤-20°C的溫度下儲(chǔ)存6個(gè)月，避光，解凍時(shí)間不超過在這段時(shí)間內(nèi)兩次。

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:

用FLICA染色細(xì)胞可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。然而FLICA用于活細(xì)胞，需要定期維護(hù)和提前幾天栽培。此外，一旦正確的數(shù)字已經(jīng)培養(yǎng)了個(gè)細(xì)胞，必須為實(shí)驗(yàn)分配時(shí)間治療或半胱天冬酶激活過程。創(chuàng)建細(xì)胞群，例如：

a、 暴露于實(shí)驗(yàn)處理的細(xì)胞

b、 接受安慰劑的陰性對(duì)照細(xì)胞群治療

當(dāng)FLICA檢測(cè)到催化活性形式的胱天蛋白酶時(shí)酶，計(jì)劃實(shí)驗(yàn)，以使FLICA在細(xì)胞中預(yù)期胱天蛋白酶被激活時(shí)被稀釋和給藥。30X FLICA的推薦體積為每300µL細(xì)胞10µL3-5 x 105細(xì)胞/mL，但數(shù)量可能因?qū)嶒?yàn)而異條件和用于分析的儀器。每位研究者應(yīng)調(diào)整FLICA的量以適應(yīng)特定細(xì)胞系研究條件。

將細(xì)胞培養(yǎng)至適合特定實(shí)驗(yàn)條件的最佳密度或凋亡誘導(dǎo)方案。細(xì)胞密度不應(yīng)超過106細(xì)胞/

超過此濃度培養(yǎng)的細(xì)胞可開始自然生長(zhǎng)進(jìn)入凋亡。可能需要進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)來確定何時(shí)以及使用多少FLICA作為產(chǎn)生的正信號(hào)是培養(yǎng)過程中caspase活性的直接測(cè)量時(shí)期.

圖：Jurkat細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞）用ICT的綠色FAM-LICA標(biāo)記聚半胱天冬酶抑制劑FAM-VAD-FMK（試劑盒#92）顯微鏡熒光?；疑?span style="font-family: Calibri;">DIC圖像（B）顯示了但其中只有四個(gè)發(fā)出綠色熒光（A）。四個(gè)（共個(gè)）5個(gè)細(xì)胞凋亡，并存在活性胱天蛋白酶（綠色）。