中國(guó)倉(cāng)鼠 卵巢細(xì)胞(CHO-S)
細(xì)胞介紹
貼壁生長(zhǎng)及懸浮生長(zhǎng)均可（用于蛋白表達(dá)時(shí)，應(yīng)使用懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)更好，比表面積更高，生物反應(yīng)器中的傳質(zhì)、傳熱效率更高，同時(shí)也可提高生物反應(yīng)器空間使用效率。工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)單抗，重組蛋，大部分使用懸浮培養(yǎng)法來(lái)生產(chǎn)）
 
細(xì)胞特性
1  來(lái)源：中國(guó)倉(cāng)鼠
2  形態(tài) ：成纖維細(xì)胞樣
3  含量：>1x10 6 個(gè)/mL
4  污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)為陰性
5  規(guī)格：T25 瓶或者 1mL 凍存管包裝
 
運(yùn)輸和保存 ：可選擇干冰運(yùn)輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細(xì)胞方式：（1）干冰運(yùn)輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇；（2）存活細(xì)胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長(zhǎng)，傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)步驟。
 
中國(guó)倉(cāng)鼠 卵巢細(xì)胞(CHO-S)細(xì)胞用途：僅供使用。
細(xì)胞培養(yǎng)步驟
一． 培養(yǎng)基 及 培養(yǎng) 凍存 條件準(zhǔn)備：
1）培養(yǎng)基信息：EX-CELL CD-CHO CHO Serum-free Medium,ChemicallyDefined(Sigma-Aldrich)添加物：L- 谷氨酰胺（Sigma-Aldrich）Anti-Clumping Agent(Gibco)備注 ：CD-CHO CHO Serum-free Medium 請(qǐng)按照培養(yǎng)基配制說(shuō)明書(shū)配制，L-谷氨酰胺配制濃度為 200mM，工作濃度為 8mM（即稀釋 25 倍，如 500ml CHO Serum-freMedium 中添加 20ml 200mM L-谷氨酰胺，抗結(jié)團(tuán)劑使用為 1%，即 500ml CHOSerum-free Medium 中添加 5ml 抗結(jié)團(tuán)劑）
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37 攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為 70%-80%。
3）凍存液：90%*培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
二． 細(xì)胞 處理 ：
傳代、轉(zhuǎn)染、建庫(kù)及實(shí)驗(yàn)室規(guī)模小試方法：賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司提供的 CHO-S 細(xì)胞為已馴化的細(xì)胞，具有良好的適應(yīng)懸浮生長(zhǎng)及適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基生長(zhǎng)特性。
傳代 方法：
1.10cm 皿中培養(yǎng)：使用計(jì)數(shù)器（計(jì)數(shù)器或者血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)）計(jì)數(shù)，接種密度為 3×10 5 個(gè)細(xì)胞/ml 接種于提前 37℃預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基中（建議培養(yǎng)基取 7-8ml，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好），置于搖床上生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)速為 120-130rpm，濕度為 70-80%，5%二氧化碳，溫度為 37℃。
2.培養(yǎng)約 2-3 天，細(xì)胞密度達(dá)到 1×10 6 個(gè)活細(xì)胞/ml 時(shí)，應(yīng) 1000rpm，25℃離心5min，離心后計(jì)數(shù)（此時(shí)應(yīng)稀釋），然后接種密度為 3×10 5 個(gè)細(xì)胞/ml 接種于提前 37℃預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基中。細(xì)胞數(shù)目足夠時(shí)，可凍存。也可選擇 125ml 或者 250ml 搖瓶中培養(yǎng)細(xì)胞。（注意細(xì)胞培養(yǎng)液體積一般在總體積的五分之一，如在 125ml 搖瓶中加入 25ml 培養(yǎng)物，應(yīng)注意在搖瓶中培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)將瓶蓋稍微擰松，以便于氣體交換，同時(shí)也不宜擰得過(guò)松，防止細(xì)胞污染）
轉(zhuǎn)染 方法：
在連續(xù) 5 代細(xì)胞密度未超過(guò) 2×10 6 個(gè)活細(xì)胞/ml 時(shí)，可以使用 FreeStyle Max 轉(zhuǎn)染試劑（Gibco，貨號(hào)：16447）在 CD CHO Serum-free Medium 中直接轉(zhuǎn)染。（注
意：Anti-Clumping Agent 會(huì)干擾 FreeStyle Max 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)也會(huì)干擾其他脂質(zhì)體型轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率）
建庫(kù)方法 ：
若需要建庫(kù)，可將細(xì)胞接種于 125ml 搖瓶中（接種密度為 3×10 5 個(gè)細(xì)胞/ml，總體積為 25ml），此方法同樣適用于穩(wěn)定表達(dá)所需要蛋白的細(xì)胞株的建庫(kù)工作。建庫(kù)時(shí)，需要先建初級(jí)庫(kù)（master bank）（一般為 10 支，每支細(xì)胞總數(shù)不少于 4.5×10 7 個(gè)細(xì)胞），此步驟結(jié)束后，從凍存的初級(jí)庫(kù)中取出一支復(fù)蘇，按照同樣步驟建次級(jí)庫(kù)（working bank）（相同的，一般為 10 支，每支細(xì)胞總數(shù)不少于 4.5×10 7個(gè)細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)室 規(guī)模小試方法：將挑選出的穩(wěn)定細(xì)胞株從 96 孔板到 24 孔板到 6 孔板到 10cm 皿中逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后（此時(shí)需要注意在培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)及時(shí)保種，以防止后續(xù)步驟出現(xiàn)污染，及應(yīng)對(duì)可能的表達(dá)量衰退現(xiàn)象）以 3×10 5 個(gè)細(xì)胞/ml 接種于 125ml 搖瓶中，轉(zhuǎn)速為120-130rpm，溫度為 37℃，濕度為 70-80%，連續(xù)培養(yǎng)一周，每天取樣做出相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞活率曲線，蛋白表達(dá)曲線，可根據(jù)實(shí)際情況，每天取樣測(cè)出培養(yǎng)基中葡萄糖含量，以便決定是否要補(bǔ)加葡萄糖，同時(shí)可使用 CHO Feedioreactor Supplement 作為細(xì)胞發(fā)酵中補(bǔ)料，同時(shí)做出相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞活率曲線，蛋白表達(dá)曲線，為中試放大補(bǔ)料添加做出合理數(shù)據(jù)支持。
 
中國(guó)倉(cāng)鼠 卵巢細(xì)胞(CHO-S)注意事項(xiàng)：
1. 收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們電聯(lián)。
2. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。