ELISA酶結(jié)合物的制備的進程

2020年07月14日 09:07上海通蔚實業(yè)有限公司點擊量：265

ELISA酶結(jié)合物的制備
免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic technique)又稱酶免疫測定法,是繼免疫熒光技術(shù)和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的又一種免疫符號技術(shù)。它是把抗原抗體的特異性反應和酶的催化作用相結(jié)合而建立的。該技術(shù)通過化學方法將酶與抗體或抗抗體結(jié)合，構(gòu)成酶符號物，這些酶符號物仍堅持免疫學活性和酶的活性，然后將它與相應的抗體或抗原起反應，構(gòu)成酶符號復合物，結(jié)合在免疫復合物上的酶，在遇到相應的底物時，則催化底物發(fā)生水解、氧化或恢復等反應，而生成可溶性或不溶性有色物質(zhì)。然后依據(jù)顯色的深淺來反映待測樣品中抗原或抗體的含量，如生成的有色物質(zhì)為可溶性，則可用肉眼比色或酶標測定儀測定光密度值(OD)定性或定量；如生成的有色物質(zhì)為不溶性沉淀物，同時又是電子細密物質(zhì)，則可用光學顯微鏡或電子顯微鏡辨認和定位。因而，免疫酶技術(shù)是一項定位、定性和定量(敏感度可達每毫升nG~pGshui平)的綜合技術(shù)。常用的酶是辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)。

酶結(jié)合物的制備
酶標抗體或抗抗體(抗免疫球蛋白)結(jié)合物可選用戊二醛法或過酸鹽氧化法制備。郭春祥建立的辣根過氧化物酶(HRP)符號抗體的改進過酸鈉法簡單易行，符號作用好，特別適用于實驗室的小批量制備?，F(xiàn)將操作方法介紹如下：

(一) 結(jié)合物的符號將5mG HRP溶于05ml蒸餾水中，參與新配制的006mol/L NaIO4水溶液05ml，混勻，置冰箱30min，取出參與016mol/L乙醇水溶液05ml，室溫放置30min后，參與含5mG純化抗體的水溶液(或PBS)1ml，混勻并裝透析袋，以005mol/L、pH值95碳酸鹽緩沖液緩慢攪拌透析6h(或過夜)使之結(jié)合，然后吸出加NaBH4溶液(5mG/ml)02ml，置冰箱2h。將上述結(jié)合物混合液參與等體積飽滿硫酸銨，冰箱放置30min，離心，將所得沉淀物溶于少數(shù)002mol/L、pH值74 PBS中，并對之透析過夜。次日再離心除去不溶物，即得酶抗體結(jié)合物。用002mol/L、pH值74 PBS加至5ml，進行測定后，冷凍干燥或低溫保存。酶結(jié)合物的制備

(二) 結(jié)合物中HRP與抗體量的測定酶標結(jié)合物于751型分光光度計上分別用280及403nm波長測定其光密度(OD)，并計算出OD403與OD280之比值以及HRP與抗體的mol/L比。
結(jié)合物中HRP濃度(mG/ml)=OD403×04
結(jié)合物中IG濃度(mG/ml)=(OD280-OD403×03)×062
酶/抗體mol/L比=HRP濃度IGG濃度×4

(三) 結(jié)合物稀釋度的測定
用酶結(jié)合物中抗體相應的抗原直接包被聚苯乙烯反應板，選用ELISA直接法測定酶結(jié)合物效價。一般本法制備的酶結(jié)合物作1∶10 000稀釋時，其OD403仍在01以上。

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