三步搞定免疫沉淀！

2019年03月11日 15:52武漢艾美捷科技有限公司點(diǎn)擊量：555

免疫沉淀的影響因素

免疫沉淀的成功依賴于抗原的純度以及制備抗體的難易，主要受兩方面因素的影響:1、抗原原液的豐度，2、抗體對抗原的親和力。

有3種類型的抗體可用于免疫沉淀:多克隆抗體，混合單克隆抗體和單克隆抗體。

步：為什么要做免疫沉淀呢？

IP是許多蛋白質(zhì)相關(guān)研究的重要步驟，用于研究蛋白質(zhì)的存在、相對豐度、蛋白表達(dá)的上下調(diào)、蛋白至穩(wěn)定性及相互作用等。

（傳統(tǒng)IP原理圖）

總結(jié)：

IP的整個過程我需要用到的關(guān)鍵工具有：

一抗：選擇能與我的樣本發(fā)生反應(yīng)，能做IP實(shí)驗(yàn)的一抗；

選擇指南:

BMR20500	PurKine™ Protein A Resin
BMR20504	PurKine™ Protein A Resin 4FF
BMR20600	PurKine™ Protein G Resin
BMR20604	PurKine™ Protein G Resin 4FF
BMR20704	PurKine™ Protein A/G Resin 4FF

第二步：發(fā)現(xiàn)竟然沒有合適的一抗來滿足我需要做的免疫沉淀？

某些目的蛋白因?yàn)闆]有對應(yīng)的特異性抗體而無法進(jìn)行免疫沉淀，如抗體所識別的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽，無法與目的蛋白相互作用或抗體選擇不合適，所選抗體不能識別處于天然構(gòu)象的蛋白等，可以采用一個表位標(biāo)記蛋白后，再選擇針對此表位的標(biāo)簽抗體來進(jìn)行免疫沉淀。廠家會推出一些常見的標(biāo)簽抗體用于IP實(shí)驗(yàn)，涉及flag、HA、His、Myc等標(biāo)簽，以滿足大多數(shù)客戶的需求。

特別是瓊脂糖/磁珠偶聯(lián)的標(biāo)簽抗體，能大限度優(yōu)化免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，節(jié)省時間和成本。

1）原理：省去了Protein A/G與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合的步驟，且解決了Protein A/G和抗體結(jié)合能力弱的問題。偶聯(lián)抗體直接和目標(biāo)蛋白結(jié)合后，通過離心或使用磁力架，將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞裂解液中分離出來。高特異性單克隆標(biāo)簽抗體可實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量和高純度，穩(wěn)定、預(yù)封閉的填料及特異性抗體減少了免疫沉淀過程中的非特異性結(jié)合。

（瓊脂糖/磁珠偶聯(lián)的標(biāo)簽抗體應(yīng)用于IP）

2）選擇指南：

A02010AGB	Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody (1B10), Agarose
A02010MGB	Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody (1B10), Magnetic Beads
A02040AGB	Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody (4F6), Agarose
A02040MGB	Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody (4F6), Magnetic Beads
A02050AGB	Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody (5C3), Agarose
A02050MGB	Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody (5C3), Magnetic Beads
A02060AGB	Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody (2D5), Agarose
A02060MGB	Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody (2D5), Magnetic Beads

第三步：免疫沉淀后WB (IP-WB)出現(xiàn)重鏈、輕鏈干擾，怎么辦？

在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)后的WB驗(yàn)證環(huán)節(jié)中，當(dāng)使用常規(guī)的 Anti-IgG (H+L) 酶標(biāo)二抗時，通常會出現(xiàn)對應(yīng)免疫沉淀一抗變性后產(chǎn)生的重鏈（50kDa）和輕鏈（25kDa）兩條帶。如果檢測的目的蛋白分子量在此附近時，就會受到這兩條帶的干擾。如何避免干擾，

方法一：選擇只和重鏈或輕鏈反應(yīng)的二抗。如果目標(biāo)蛋白分子量小于30KD，為了避免抗體輕鏈的干擾，選擇重鏈特異性二抗；如果目標(biāo)蛋白分子量大于30KD，為了避免抗體重鏈的干擾，選擇輕鏈特異性二抗；

選擇指南：

A25012	IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG LCS	輕鏈特異性
A25022	IPKine™ HRP, Mouse Anti-Rabbit IgG LCS	輕鏈特異性
A25112	IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG HCS	重鏈特異性
A25222	IPKine™ HRP, Goat Anti-Rabbit IgG HCS	重鏈特異性

“使用IPKine Mouse Anti-Rabbit IgG LCS 輕鏈特異性二抗檢測NUP50蛋白的IP結(jié)果，解決重鏈干擾問題！ ” CAT #: A25022

方法二：選擇WB一抗時，選擇和IP用一抗不同的種屬，避免IP一抗的干擾；

方法三：選擇HRP直接偶聯(lián)的WB一抗，省去二抗的步驟。

免疫沉淀三步擊破，你掌握了嗎？如有疑問，歡迎來撩！

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