一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />　　
　　1.掌握DNA指紋圖譜技術(shù)的概念、原理和基本操作過(guò)程
　　
　　2.學(xué)習(xí)DNA的限制性酶切的基本技術(shù)
　　
　　3.掌握瓊脂糖凝膠電泳的基本操作技術(shù)，學(xué)習(xí)利用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA片段的長(zhǎng)度，并能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　
　　二.實(shí)驗(yàn)原理
　　
　　1984年英國(guó)萊斯特大學(xué)的遺傳學(xué)家Jefferys及其合作者將分離的人源小衛(wèi)星DNA用作基因探針，同人體核DNA的酶切片段雜交，獲得了由多個(gè)位點(diǎn)上的等位基因組成的長(zhǎng)度不等的雜交帶圖紋，這種圖紋極少有兩個(gè)人*相同，故稱(chēng)為"DNA指紋"，意思是它同人的指紋一樣是每個(gè)人所*的。DNA指紋的圖像在X光膠片中呈一系列條紋，很像商品上的條形碼。DNA指紋圖譜，開(kāi)創(chuàng)了檢測(cè)DNA多態(tài)性(生物的不同個(gè)體或不同種群在DNA結(jié)構(gòu)上存在著差異)的多種多樣的手段，如RFLP(限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性)分析、串聯(lián)重復(fù)序列分析、RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)分析等等。各種分析方法均以DNA的多態(tài)性為基礎(chǔ)，產(chǎn)生具有高度個(gè)體特異性的DNA指紋圖譜，由于DNA指紋圖譜具有高度的變異性和穩(wěn)定的遺傳性，且仍按簡(jiǎn)單的孟德?tīng)柗绞竭z傳，成為目前吸引力的遺傳標(biāo)記。
　　
　　DNA指紋具有下述特點(diǎn)：1.高度的特異性：研究表明，兩個(gè)隨機(jī)個(gè)體具有相同DNA圖形的概率僅3×10-11;如果同時(shí)用兩種探針進(jìn)行比較，兩個(gè)個(gè)體*相同的概率小于5×10-19。*人口約50億，即5×109。因此，除非是同卵雙生子女，否則幾乎不可能有兩個(gè)人的DNA指紋的圖形*相同。2.穩(wěn)定的遺傳性：DNA是人的遺傳物質(zhì)，其特征是由父母遺傳的。分析發(fā)現(xiàn)，DNA指紋圖譜中幾乎每一條帶紋都能在其雙親之一的圖譜中找到，這種帶紋符合經(jīng)典的孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，即雙方的特征平均傳遞50%給子代。3.體細(xì)胞穩(wěn)定性：即同一個(gè)人的不同組織如血液、肌肉、毛發(fā)、等產(chǎn)生的DNA指紋圖形*一致。
　　
　　1985年Jefferys博士首先將DNA指紋技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)鑒定。1989年該技術(shù)獲美國(guó)國(guó)會(huì)批準(zhǔn)作為正式法庭物證手段。我國(guó)警方利用DNA指紋技術(shù)已偵破了數(shù)千例疑難案件。DNA指紋技術(shù)具有許多傳統(tǒng)法醫(yī)檢查方法不具備的優(yōu)點(diǎn)，如它從四年前的精斑、血跡樣品中，仍能提取出DNA來(lái)作分析;如果用線粒體DNA檢查，時(shí)間還將延長(zhǎng)。此外千年古尸的鑒定，在俄羅斯革命時(shí)期被處決沙皇尼古拉的遺骸，以及zui近在前南地區(qū)的一次意外事故中機(jī)毀人亡的已故美國(guó)商務(wù)部長(zhǎng)布朗及其隨行人員的遺骸鑒定，都采用了DNA指紋技術(shù)。
　　
　　此外，它在人類(lèi)醫(yī)學(xué)中被用于個(gè)體鑒別、確定親緣關(guān)系、醫(yī)學(xué)診斷及尋找與疾病連鎖的遺傳標(biāo)記;在動(dòng)物進(jìn)化學(xué)中可用于探明動(dòng)物種群的起源及進(jìn)化過(guò)程;在物種分類(lèi)中，可用于區(qū)分不同物種，也有區(qū)分同一物種不同品系的潛力。在作物的基因定位及育種上也有非常廣泛的應(yīng)用。
　　
　　DNA指紋圖譜法的基本操作：從生物樣品中提取DNA(DNA一般都有部分的降解)，可運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出高可變位點(diǎn)(如VNTR系統(tǒng)，串聯(lián)重復(fù)的小衛(wèi)星DNA等)或者完整的基因組DNA，然后將擴(kuò)增出的DNA酶切成DNA片斷，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，按分子量大小分離后，轉(zhuǎn)移至尼龍濾膜上，然后將已標(biāo)記的小衛(wèi)星DNA探針與膜上具有互補(bǔ)堿基序列的DNA片段雜交，用放射自顯影便可獲得DNA指紋圖譜。
　　
　　瓊脂糖凝膠電泳是分離，鑒定和純化DNA片段的常規(guī)方法。利用低濃度的熒光嵌入染料-溴化乙錠進(jìn)行染色，可確定DNA在凝膠中的位置。如有必要，還可以從凝膠中回收DNA條帶，用于各種克隆操作。瓊脂糖凝膠的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝膠低，但其分離范圍較廣。用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長(zhǎng)度為200bp至近50kbp的DNA。長(zhǎng)度100kb或更大的DNA，可以通過(guò)電場(chǎng)方向呈周期性變化的脈沖電場(chǎng)凝膠電泳進(jìn)行分離。
　　
　　在基因工程的常規(guī)操作中，瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用。它通常采用水平電泳裝置，在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下進(jìn)行電泳。DNA分子在凝膠緩沖液(一般為堿性)中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中由負(fù)極向正極遷移。DNA分子遷移的速率受分子大小，構(gòu)象。電場(chǎng)強(qiáng)度和方向，堿基組成，溫度和嵌入染料等因素的影響。
　　
　　三.實(shí)驗(yàn)材料和試劑
　　
　　1.DNA樣品：*現(xiàn)場(chǎng)DNA樣品(CS)、嫌疑犯1DNA樣品(S1)、嫌疑犯2DNA樣品(S2)、嫌疑犯3DNA樣品(S3)、嫌疑犯4DNA樣品(S4)、嫌疑犯5DNA樣品(S5)
　　
　　2.化學(xué)試劑和溶液
　　
　　(1)DNA樣品反應(yīng)緩沖液：100mMTris,200mMNaCl,20mMMgCl2,2mMDTT,pH8.0。
　　
　　(2)EcoRⅠ限制性?xún)?nèi)切酶
　　
　　(3)PstⅠ限制性?xún)?nèi)切酶
　　
　　(4)電泳緩沖液(50×TAE)
　　
　　Tris242g
　　
　　冰醋酸57.1ml
　　
　　EDTA(0.5mol/LpH8.0)100ml
　　
　　使用時(shí)用蒸餾水稀釋50倍。
　　
　　(5)樣品緩沖液(DNAsampleloadingdye)
　　
　　0.25%溴酚藍(lán)
　　
　　0.25%二甲苯青
　　
　　40%(W/V)蔗糖
　　
　　(6)溴化乙錠(EB)10mg/ml
　　
　　(7)瓊脂糖agarose(電泳級(jí))
　　
　　(8)DNA分子量標(biāo)記物：LambdaHindⅢDNAmarkers
　　
　　3.儀器設(shè)備和消耗品
　　
　　電泳儀、電泳槽、樣品梳、微波爐、水浴鍋、移液器(10μl，200μl，1000μ)、離心管、一次性槍頭(200μl，1000μl)。
　　
　　四.實(shí)驗(yàn)步驟
　　
　　1.DNA樣品的制備
　　
　　采集生物檢測(cè)樣本，在弱堿和螯合劑存在條件下進(jìn)行組織勻漿，溶解細(xì)胞或細(xì)胞核膜;利用陰離子去垢劑和蛋白酶，在37℃孵化數(shù)小時(shí)，消化蛋白質(zhì)分離DNA;使用有機(jī)溶劑如苯酚、氯仿等除去殘余蛋白質(zhì)，萃取DNA;用乙醇或某些鹽類(lèi)從溶液中沉淀DNA。
　　
　　由于一般采集的樣本中的DNA都有不同程度的降解，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出完整的基因組DNA或者特定的高可變位點(diǎn)，以此制備出的DNA樣品備用。
　　
　　2.DNA樣品的酶切反應(yīng)
　　
　　設(shè)置DNA樣品的雙酶切反應(yīng)，按下列順序加樣(體積：μl)：
　　
　　反應(yīng)管對(duì)照管
　　
　　樣品DNA1010
　　
　　反應(yīng)緩沖液(10×)22
　　
　　雙蒸水68
　　
　　EcoRⅠ10
　　
　　PstⅠ10
　　
　　總體積2020
　　
　　加完反應(yīng)液，溫和混勻，置于37℃水浴中反應(yīng)1小時(shí)，取出備用。
　　
　　3.酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳
　　
　　(1)在100ml電泳緩沖液(1TAE或0.5TBE)中加入1g瓊脂糖，加熱熔化，注意觀察，當(dāng)心煮沸的液體，溢出!當(dāng)凝膠冷卻至60℃左右時(shí)加入5μl溴化乙錠溶液終濃度為(1μg/ml)，充分混勻。
　　
　　(2)先用透明膠帶封固膠托邊緣，放好梳子，然后再倒入凝膠(凝膠厚度在5mm左右)。
　　
　　(3)在凝膠*凝固后(室溫放置30-45分鐘)，小心移去梳子和透明膠帶，將凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液(液面超過(guò)膠帶約2-3mm)。
　　
　　(4)取已制備好的酶切DNA樣品，加入1/5樣品緩沖液，充分混勻。用移液器將樣品小心地加入點(diǎn)樣孔。在不同的點(diǎn)樣孔中，分別加入DNA分子量標(biāo)記物，對(duì)照以及酶切DNA樣品各5-10ml。
　　
　　(5)蓋上電泳槽，打開(kāi)電源并調(diào)節(jié)電壓(通常用50-100伏)，電泳40-60分鐘(注意：DNA樣品從負(fù)極向正極泳動(dòng))。
　　
　　4.結(jié)果觀察與分析
　　
　　關(guān)閉電源，取出凝膠，在紫外燈下觀察DNA的遷移位置，并討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果。判斷CS與哪一個(gè)DNA樣品是同一個(gè)樣品，找出罪犯。
　　
　　五.注意事項(xiàng)
　　
　　(1)酶切時(shí)，應(yīng)盡量減少反應(yīng)中的加水量以使反應(yīng)體系減到zui小。但要確保酶體積不超過(guò)反應(yīng)總體積的十分之一，否則限制酶活性將受到甘油的抑制。
　　
　　(2)進(jìn)行酶切消化時(shí)，將除酶以外的所有反應(yīng)成分加入后再?gòu)谋渲腥〕雒?，并?yīng)放置于冰上。每次取