克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應(yīng)用。大腸桿菌用于表達重組蛋白有以下特點：
易于生長和控制；用于細菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細胞系統(tǒng)的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)?？晒┻x擇。但是，在大腸桿菌中表達的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。
表達載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達載體通常為質(zhì)粒，典型的表達載體應(yīng)具有以下幾種元件：
?。?）選擇標志的編碼序列；
?。?）可控轉(zhuǎn)錄的啟動子；
?。?）轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子，核糖體結(jié)合位點)；
?。?）一個多限制酶切位點接頭；
?。?）宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列。
原核表達一般程序如下：
獲得目的基因－準備表達載體－將目的基因插入表達載體中（測序驗證）－轉(zhuǎn)化表達宿主菌－誘導(dǎo)靶蛋白的表達－表達蛋白的分析－擴增、純化、進一步檢測
一、試劑準備
1、LB培養(yǎng)基。
2、100mMIPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38gIPTG溶于100mlddH2O中，0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存。
二、操作步驟
（一）獲得目的基因
1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA*鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
?。ǘ?gòu)建重組表達載體
1、載體酶切：將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
（三）獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種
1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標志（抗Amp或藍白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。
2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。
?。ㄋ模┱T導(dǎo)表達
1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養(yǎng)。
2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0（0.6，大約需3hr）。
3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實驗組，兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。
4、分別取菌體1ml，離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl1%SDS重懸，混勻，70℃10min。
5、離心12000g×1min，取上清作為樣品，可做SDS-PAGE等分析。
三、注意事項
1、選擇表達載體時，要根據(jù)所表達蛋白的zui終應(yīng)用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達。
2、融合表達時在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)時，對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。
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