小鼠胸腺細(xì)胞增殖法測(cè)定slL-1的生物活性原理

    其原理是IL-1可協(xié)同有絲分裂原(ConA或PI-lA)刺激T細(xì)胞或胸腺細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)。同時(shí)IL-1可刺激T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(如IL-2)。此法是目前測(cè)定IL-1zui常用而簡(jiǎn)便的方法，其敏感度為10—50pg／mL。但缺乏特異性，因?yàn)镮L-2同樣可以協(xié)同有絲分裂原刺激胸腺細(xì)胞增殖，并且在細(xì)胞的增殖過(guò)程中可受樣品中T細(xì)胞增殖抑制因子的干擾。

    (1)拉頸處死小鼠(6—8周齡)，取胸腺置含RPMI-1640*培養(yǎng)液的平皿中。

    (2)將胸腺剪碎(或毛玻璃磨碎)，無(wú)菌紗布過(guò)濾，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。

    (3)1 500r／min，10min，離心洗滌細(xì)胞2次，然后懸于含5％NBS的RPMI-1640*培養(yǎng)液中，使細(xì)胞濃度為1．5X107／mL。

    (4)ConA(或PHA)亞適劑量的確定：測(cè)定樣本前必須作ConA劑量曲線，觀察其對(duì)胸腺細(xì)胞增殖的影響。選擇ConA的亞適劑量，即能夠激活胸腺細(xì)胞，但又不引起明顯增殖的劑量，操作步驟如下：

    ①在96孔培養(yǎng)板中，每孔加100uLConA，終濃度分別為0．5 ug/mL，如1ug/mL，2 ug/mL，5 ug/mL，10 ug/mL，各設(shè)三個(gè)復(fù)孔，以不加ConA的培養(yǎng)液作對(duì)照；

    ②各孔加100~L胸腺細(xì)胞，37℃，5％C0₂溫育72h，收獲前12h加0．5uCi的³H-TdR 50uL／孔；

    ③用微量細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上，用b液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定³H-TdR摻人量；

    ④數(shù)據(jù)(cpm)以三個(gè)復(fù)孔的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，據(jù)此選擇ConA作用的亞適劑量，通常為0．2-2。0ug／mL。

    (5)將含IL-1的待測(cè)樣品上清倍比稀釋加到96孔板中，每孔0．1mL，一式3份，設(shè)陰性對(duì)照、培養(yǎng)液對(duì)照及有絲分裂原對(duì)照，并設(shè)置不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)晶IL-1對(duì)照。

    (6)將ConA(0．2-2．0 ug/mL)或PHA(0．5～4 ug/mL)混入細(xì)胞懸液中，分別加至96孔板中，0．1ml/孔。

    (7)5％C02，37℃；溫箱中孵育72h，收集*～12h加³H-TdR 0．5uzCi/孔。

    (8)收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上，測(cè)定’H-TdR摻人量。