減少引物二聚體的方法
1. 從引物自身著手,重新設(shè)計(jì)引物,這是zui根本解決這一問(wèn)題的辦法。
2. 可能模板有問(wèn)題。
3. 模板濃度過(guò)小,適當(dāng)加大模板量。
4. Taq酶,引物,Mg2+濃度可能過(guò)高,可降低它們的濃度。
5. 取你所要加的上下游引物混合后,在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘,然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時(shí)冷卻,這時(shí)再加入反應(yīng)體系當(dāng)中,引物二聚體就會(huì)消失的。
6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增強(qiáng)特異性。
7. PCR反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行,zui后加TAq酶,PCR結(jié)束后,產(chǎn)物勿放置在室溫下過(guò)長(zhǎng)時(shí)間,有人認(rèn)為室溫下有些TAQ酶會(huì)將多余的引物合成為二聚體。
8. 增加循環(huán)數(shù)。
9. 降低退火溫度后有條帶,則應(yīng)逐漸提高溫度,若提高溫度的同時(shí)產(chǎn)物量減少,則考慮增加鎂離子濃度(根據(jù)擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度而定,片段長(zhǎng)則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些)。
10. 若降低退火溫度,發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體,而且鎂離子的濃度在 20-25 mmol/l 沒(méi)有區(qū)別,則考慮Buffer等試劑沒(méi)有*融解、混勻,導(dǎo)致吸取的試劑濃度不對(duì)。
11. 以上次的pcr產(chǎn)物作模板二次pcr,可以提高引物與模板的特異性,減少引物二聚體,如果兩次時(shí)間間隔短的話,可以把原產(chǎn)物稀釋100-1000倍,如果間隔較長(zhǎng)可以稀釋50-100倍。