一、技術(shù)背景：
　　
　　Adeasy系統(tǒng)利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度濃縮等優(yōu)點(diǎn)，并破壞了腺病毒基因組中的早期基因E1，使之成為較為安全、的病毒載體。利用帶有E1基因的293細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，通過(guò)倍比擴(kuò)增，富集病毒顆粒，并通過(guò)CsCl梯度離心，透析進(jìn)行分離純化。對(duì)絕大多數(shù)的細(xì)胞株可以達(dá)到近乎100％的感染效率。但需要指出的是Adeasy同樣具有所有病毒載體或轉(zhuǎn)染試劑都不可避免的細(xì)胞毒性問(wèn)題。
　　
　　二、所需試劑：
　　
　　1.293細(xì)胞；
　　
　　2.重組好的腺病毒質(zhì)粒；
　　
　　3.PacI限制性?xún)?nèi)切酶；
　　
　　4.質(zhì)粒回收相關(guān)試劑；
　　
　　5.細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑；
　　
　　6.TBS：10mMTris,0.9%NaCl，pH8.1；
　　
　　7.40%CsCl：28.45gCsCl溶于42.7ml的TBS中，4度保存；
　　
　　8.15%CsCl：9.085gCsCl溶于47.69ml的TBS中，4度保存；
　　
　　9.Beckman離心管：14*89mm，SW41轉(zhuǎn)頭；
　　
　　10.Polybrene（sigma），10mg/ml；
　　
　　11.透析袋：SpectrumCo.（成卷供應(yīng)，帶少量甘油，硫化物與重金屬），MW=8000~14400；
　　
　　12.滅菌甘油。
　　
　　三、操作流程：
　　
　　1.293細(xì)胞（E1-transformedhumanembryonickidneycells在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)接種于1或2個(gè)60mm培養(yǎng)盤(pán)中，使之在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合率為50-70%；
　　
　　2.在轉(zhuǎn)染前，用PacI處理目的質(zhì)粒（一般一個(gè)60mm細(xì)胞盤(pán)需要6μgDNA）。處理后質(zhì)粒用乙醇沉淀并重懸于20μl無(wú)菌水中；
　　
　　3.用PEI或其他轉(zhuǎn)染試劑將6μgPacI處理過(guò)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；
　　
　　4.8個(gè)小時(shí)后移去混合液，加入4mlDMEM*培養(yǎng)液（10%CBS，1%Pen/Strep）；
　　
　　5.在轉(zhuǎn)染后7到10天用細(xì)胞刮（而不是胰酶）將細(xì)胞從瓶中刮下并移入50ml錐形管。離心后將細(xì)胞重懸于2.0mlPBS或全培液中。于液氮中凍結(jié)細(xì)胞，37℃水浴中溶解，劇烈振蕩。此步驟共進(jìn)行4次。注意保存時(shí)不要反復(fù)凍融，可保存于-20℃；
　　
　　6.將293細(xì)胞以50-70%的匯合率鋪于60mm培養(yǎng)盤(pán)中，以30-50%的體積比加入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明顯的細(xì)胞裂解或CPE現(xiàn)象；
　　
　　7.在有1/3到1/2的細(xì)胞脫離漂浮時(shí)，通常是感染后3-5天收集病毒?？蛇M(jìn)一步通過(guò)Westernblot或PCR（5μl病毒上清加上10μlPCR-gradeProteaseK，55℃消化1小時(shí)，然后煮沸樣品5min，離心后取1-2μl進(jìn)行PCR反應(yīng)）證實(shí)重組腺病毒的存在；
　　
　　8.按步驟5的方法收集病毒上清。在這種情況下一般至少可收集到107infectiousparticles/ml的病毒。每輪的擴(kuò)增應(yīng)能提高一個(gè)數(shù)量級(jí)的梯度；
　　
　　9.為了進(jìn)一步擴(kuò)增，將步驟8獲得的病毒上清進(jìn)一步感染100mm培養(yǎng)盤(pán)的細(xì)胞，按步驟5的方法收集病毒，并進(jìn)而將其感染150mm細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)中的293細(xì)胞，以獲得足夠量的病毒；
　　
　　10.將15%CsCl和40%CsCl加入Beckman離心管中制備CsCl梯度溶液；
　　
　　11.將zui終富集病毒顆粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；
　　
　　12.超速離心，30000rpm，4度離心16個(gè)小時(shí)；
　　
　　13.離心后，應(yīng)有兩條帶。位置較高，顏色較弱的條帶主要為腺病毒空殼，不具感染能力；位置較低，顏色較亮的條帶含有我們需要收集的活病毒顆粒。用16號(hào)針頭將這一條帶收集；
　　
　　14.在TBS中透析一小時(shí)，隨后在含有10％甘油的TBS中透析兩次，每次一小時(shí)；
　　
　　15.將純化的腺病毒分裝于EP管中；
　　
　　16.在EppendorfBiophotometer中測(cè)量透析液中的總蛋白量，1μg病毒蛋白相當(dāng)于4×109病毒顆粒；
　　
　　17.長(zhǎng)期保存于-70度中，短期可保存于4度，切忌反復(fù)凍溶；
　　
　　18.由于腺病毒對(duì)不同細(xì)胞株的感染效率存在差異，且考慮到病毒顆粒的細(xì)胞毒副作用，通常通過(guò)梯度感染的方法確定所需的病毒用量。以相對(duì)細(xì)胞數(shù)1：1，10：1，100：1，1000：1的病毒顆粒感染靶細(xì)胞；加入相對(duì)培養(yǎng)液體積1：1000的Polybrene。在37度下平板離心30分鐘；
　　
　　19.感染8~12小時(shí)后換液。將含有病毒的培養(yǎng)液小心移入含有消毒液的廢液缸中，加入適量全培液。
　　
　　詳情請(qǐng)看：腺病毒的包裝，純化和感染