基因診斷的概念、常用技術(shù)
一、基本概念：

1．人類的絕大多數(shù)疾病都與基因有關(guān)，基因變異引起疾病兩種類型：

①內(nèi)源基因變異：由于先天遺傳和后天內(nèi)外環(huán)境因素的影響，人類的基因結(jié)構(gòu)及表達的各個環(huán)節(jié)都可發(fā)生異常，從而導(dǎo)致疾病。分基因結(jié)構(gòu)突變和表達異常。

②外源基因的入侵：各種病原體感染人體后，其特異的基因被帶入人體并在體內(nèi)增殖引起各種疾病?；蚋淖円鸶鞣N表型改變，從而引起疾病，從基因水平探測分析病因和疾病的發(fā)病機制，并采用針對性的手段矯正疾病是近年基礎(chǔ)和臨床的方向。

２．基因診斷：利用現(xiàn)代生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。

二、基因診斷的特點：

1．以基因做檢查材料和檢查目標(biāo)針對性強；

2．分子雜交選用特定基因序列作探針，故特異性強；

3．分子雜交和PCR具有放大效應(yīng)，故有較大的靈敏度；

4．適用性強，診斷范圍廣。

基因診斷的常用技術(shù)　

一、核酸分子雜交：

核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對規(guī)律形成雙鏈結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測樣品的不同又被分為DNA印跡雜交（Southern blot hybridization ）和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization）。

（一）核酸分子雜交的基本過程：

①DNA或RNA的制備：將待測樣品用一定方法提取DNA或RNA。

②制備探針；

③雜交；

④檢測。

1．DNA或RNA的制備：將待測樣品用一定方法提取DNA或RNA。

2．基因探針的概念：

① 基因探針（probe）就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可以僅僅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。

② 探針的來源：

DNA探針根據(jù)其來源有3種：一種來自基因組中有關(guān)的基因本身，稱為基因組探針（genomic probe）；另一種是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，稱為cDNA探針（cDNA probe）。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。此外，還可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。

③ 探針的制備：

進行分子突變需要大量的探針拷貝，后者一般是通過分子克?。╩olecular cloning）獲得的。克隆是指用無性繁殖方法獲得同一個體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。當(dāng)制備基因組DNA探針進，應(yīng)先制備基因組文庫，即把基因組DNA打斷，或用限制性酶作不*水解，得到許多大小不等的隨機片段，將這些片段體外重組到運載體（噬菌體、質(zhì)粒等）中去，再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸桿菌，這時在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通過原位雜交，從中可篩出含有目的基因片段的克隆，然后通過細(xì)胞擴增，制備出大量的探針。

為了制備cDNA 探針，首先需分離純化相應(yīng)mRNA，這從含有大量mRNA的組織、細(xì)胞中比較容易做到，如從造血細(xì)胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了 mRNA作模板后，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，就可以合成與之互補的DNA（即cDNA），cDNA與待測基因的編碼區(qū)有*相同的堿基順序，但內(nèi)含子已在加工過程中切除。

寡核苷酸探針是人工合成的，與已知基因DNA互補的，長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。如僅知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量，也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列，并用化學(xué)方法合成。

④ 探針的標(biāo)記：

為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號，通常采用放射性同位素32 P標(biāo)記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體，熒光素等作為標(biāo)記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標(biāo)記的優(yōu)點是保存時間較長，而且避免了同位素的污染。zui常用的探針標(biāo)記法是缺口平移法（nick translation）。
 

二、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：

1．核酸雜交反應(yīng)是一對一的反應(yīng)，即膜上有一個被檢測分子時，相應(yīng)就有一個標(biāo)記的探針分子與它雜交。所以整個實驗敏感性主要取決于標(biāo)記探針的質(zhì)量和雜交后的檢測方法。在優(yōu)化的條件下，核酸雜交可檢測到pg水平的靶分子，約相當(dāng)于106個分子。但是，在許多臨床情況下，即無法得到這樣的樣品量。這時可以用聚合酶鏈反應(yīng)來擴增靶分子以特異性地增加靶分子量，達到提高敏感性的目的。

2．聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction ，PCR）：

PCR的反應(yīng)本身是在同一試管內(nèi)利用DNA聚合酶催化的反應(yīng)反復(fù)進行同一段DNA片段的合成。聚合酶反應(yīng)的模板是待檢測核酸分子：DNA可直接用于反應(yīng)，而RNA則需要用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，然后用作聚合酶反應(yīng)的模板。反應(yīng)的引物有兩條，分別位于待擴增DNA片段的兩端，可啟動相對方向的DNA合成。這樣從一個模板分子起始的話，經(jīng)過n次聚合酶反應(yīng)后就可以合成2 n個模板分子。所以從很小時的樣品即有可能擴增出電泳后肉眼可見的產(chǎn)物。

3．PCR反應(yīng)：
      模板（待測 的cDNA或RNA）；　
      底物（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）； 
      引物 ；
      TaqDNA聚合酶， 反應(yīng)溫度（75-85 ℃ ）；
      變性：95℃；
      退火：55℃；
      聚合：72℃；
      檢測：電泳或核酸雜交。

4．以PCR為基礎(chǔ)的基因診斷技術(shù)：

（1）巢式PCR：先以一對外引物進行常規(guī)PCR，取一部分?jǐn)U增產(chǎn)物為模板，用另一對內(nèi)引物進行擴增反應(yīng)，提高靈敏度和特異性。

（2）多重PCR：在同一PCR反應(yīng)體系中加多對引物進行擴增反應(yīng)的方法叫多重PCR。這種方法可對某一特定的基因的不同的區(qū)域進行缺失診斷。

（3）逆轉(zhuǎn)錄PCR：這種PCR的起始模板是RNA，先以 RNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)合成，再以cDNA為模板合成雙鏈cDNA，在此基礎(chǔ)上再進行PCR。由此可見，RT-PCR在基因表達研究和對RNA病毒的基因診斷中具有特殊作用。

（4）熒光定量PCR：本方法通過對照基因的擴增或?qū)σ镞M行熒光標(biāo)記，結(jié)合一定的儀器可以對PCR產(chǎn)物進行定量。

（5）聯(lián)合PCR技術(shù)。

三、核酸序列分析法：

核酸序列分析法是zui確切的基因診斷分析法，它通過測定堿基排列序列而發(fā)現(xiàn)DNA的具體變異情況。

核酸序列分析法有兩種：化學(xué)裂解法和雙脫氧核苷酸末端終止法。

基因診斷的應(yīng)用

1．病原生物的侵入：一般侵入體內(nèi)的病原生物可通過顯微鏡檢查各免疫學(xué)方法進行診斷。但是，直接檢測病原生物的遺傳物質(zhì)可以大大提高診斷的敏感性。此外，由于基因堿基配對原理的基因診斷可直接檢測病原微生物的遺傳物質(zhì)，所以診斷的特異性也大為提高。目前，基因診斷已在病毒性肝炎，愛滋病等傳染病的診斷中發(fā)揮了不可代替的作用。

2．遺傳?。哼z傳病是指遺傳物質(zhì)（基因）的異常所導(dǎo)致的疾病，因此遺傳病的診斷，zui本質(zhì)和zui直接的是檢測出異常的基因。

從受精卵開始，各人的基因組就已確定。因此，對遺傳病高危妊娠，基因診斷可以在胎兒出生前進行，甚至早在胚胎著床前進行，這對于減少遺傳病兒的出生具有重要價值，也是目前對大多數(shù)尚沒有理想治療方法的遺傳病zui有效的預(yù)防措施。對于已經(jīng)出生的遺傳病患者，特別是如亨廷頓舞蹈癥等某些成年期才發(fā)病的患者，由于基因診斷可以在癥狀出現(xiàn)之前進行，因而能及早采取措施，避免疾病基因遺傳給后代。

3．癌癥：現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞是由受傷的基因激活的，環(huán)境污染物、微生物、某些食品或藥品等可能是造成基因損傷的根源。隨著癌基因的發(fā)現(xiàn)和抗癌基因研究的進展，癌癥是一類基因性疾病的理論已經(jīng)成立?；蛟\斷癌癥是根據(jù)DNA雜交原理，探測某種基因的存在與否、有無變異，區(qū)別變異基因?qū)倭夹曰驉盒?，從而達到診斷癌癥的目的?；蛟\斷癌癥準(zhǔn)確率高，甚至對某些人表現(xiàn)出患癌傾向性都能作出預(yù)測。

4．器官組織移植：*（包括骨髓移植）的主要難題是如何解決機體對移植物的排斥反應(yīng)。理想的方法是進行術(shù)前組織配型。基因診斷技術(shù)能夠分析和顯示基因型，更好地完成組織配型，從而提高了*的成功率。