熒光素標(biāo)記試劑與酶標(biāo)試劑

(1)酶標(biāo)試劑：酶標(biāo)抗體僅需適當(dāng)?shù)孜锖推胀ü鈱W(xué)顯微鏡即可高度敏感地檢出抗原。由于信號(hào)是通過(guò)吸收光的差異，而非發(fā)射光來(lái)檢測(cè)，底物的不溶性顯色產(chǎn)物分布在酶所在位置的周圍區(qū)域，因此這種檢測(cè)方法尚不能達(dá)到熒光技術(shù)的分辨率。

    酶反應(yīng)后出現(xiàn)沉淀，在酶所處位置周圍產(chǎn)生不溶性顯色產(chǎn)物，通過(guò)底物的顯色來(lái)檢出酶標(biāo)試劑所處位置。多種酶及底物可供選擇，但近年來(lái)多選用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)及底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB)來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的染色。

    多種試劑已經(jīng)商品化，其價(jià)格便宜，且具有較好的質(zhì)量。HRP可與抗Ig抗體、蛋白A、蛋白G、親和素或鏈霉親和素等共價(jià)偶聯(lián)，其中任何一種二級(jí)試劑均可用于檢測(cè)與目標(biāo)抗原結(jié)合的一抗的位置。

(2)熒光素標(biāo)記試劑：這種檢測(cè)方法中，樣品置于特定波長(zhǎng)的光波下進(jìn)行檢測(cè)。熒光染料的電子吸收合適波長(zhǎng)的光波后達(dá)到較高能量狀態(tài)，當(dāng)其再回到基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)，即發(fā)射出特定波長(zhǎng)的光波。這種發(fā)射光形成了在顯微鏡下所看到的熒光。

    由于樣品中熒光染料被激發(fā)后發(fā)出的熒光集中于一點(diǎn)，因此運(yùn)用熒光標(biāo)記所獲亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分辨率較透射顯微鏡更高。例如，應(yīng)用此法在熒光顯微鏡下可觀察到直徑為5nm的細(xì)胞中纖絲結(jié)構(gòu)。這就超過(guò)了的光學(xué)顯微鏡的分辨率。這種方法在敏感性方面的主要缺陷由于熒光染料在暴露于激發(fā)光后短時(shí)間猝滅所造成的相對(duì)弱的發(fā)射光，因此，此法傳統(tǒng)上用于濃度較高抗原的檢測(cè)。然而， 由于熒光染料及共聚焦掃描顯微鏡、高靈敏度照相機(jī)等圖像分析系統(tǒng)的出現(xiàn)，這個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展極為迅速。

    各種熒光染料具有不同的激發(fā)及發(fā)射光譜。安置濾光鏡能夠確保只有正確波長(zhǎng)的激發(fā)光通過(guò)以便激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。在觀察光路上安置第二套濾光鏡使得僅由熒光染料激發(fā)產(chǎn)生的發(fā)射光才能通過(guò)，這樣，觀察到的是一個(gè)僅由發(fā)射光形成的圖像，而背景是黑色的，這種圖像的分辨率很高。

    由于某些熒光染料的發(fā)射光譜并不重疊，同一樣品可同時(shí)采用2種熒光染料進(jìn)行觀察。這樣能夠同時(shí)檢測(cè)同一樣品的2種不同的抗原，甚至能夠研究其在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的分布不相同。常用的熒光染料有異硫氰酸熒光素(FITC)、羅達(dá)明和得克薩斯(Texas)紅等。

細(xì)胞染色常用染料的特性

    檢測(cè)熒光標(biāo)記的試劑需要一個(gè)特殊的顯微鏡，有兩種顯微鏡可供選擇：熒光顯微鏡較為便宜，約2萬(wàn)～5萬(wàn)美元。若細(xì)胞染色中產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度較弱，則須配置epifluore—science裝置，以使激發(fā)光通過(guò)物鏡照射在樣品上。用于免疫熒光檢測(cè)的第二種顯微鏡是共聚焦顯微鏡， 目前市面上有幾種共聚焦顯微鏡，價(jià)格在10萬(wàn)～40萬(wàn)美元之間。其原理是用高度聚焦的光線在不同的焦平面上照射樣品，從而激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光，再?gòu)母鱾€(gè)焦平面來(lái)觀察樣品，經(jīng)數(shù)字化處理后形成圖像，這樣能夠得到細(xì)胞的各個(gè)子面圖像，并且通過(guò)合成得到整個(gè)細(xì)胞的圖像。這兩種顯微鏡均能夠良好地應(yīng)用于細(xì)胞染色。

(3)熒光素與酶：兩種細(xì)胞染色法均實(shí)用。如果實(shí)驗(yàn)要求操作簡(jiǎn)單，用同一條件觀察大量樣品，用酶聯(lián)檢測(cè)法較好；如實(shí)驗(yàn)要求高分辨率，則應(yīng)用熒光素標(biāo)記檢測(cè)法；共聚焦顯微鏡比相差顯微鏡具有更高的分辨率。如考慮敏感性，選用共聚焦顯微鏡法，再依次為酶聯(lián)法及熒光顯微鏡法。如考慮到價(jià)格因素，則酶聯(lián)法為。抗體