顯色（HRP酶）

1．增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)

Ecl 顯色原理：氨基苯二酰肼類主要是魯米諾及異魯米諾衍生物，是zui常用的一類化學(xué)發(fā)光劑。魯米諾（luminol，5'-氨基-2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮）的分子結(jié)構(gòu)及化學(xué)反應(yīng)式如下：

魯米諾在免疫測定中既可用作標記物，也可用作過氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和魯米諾，在HRP（辣根過氧化物酶）的作用下，發(fā)出熒光來。ELISA試劑盒

試驗步驟：

1）將兩種顯色底物1：1等體積混合（一般各1ml/membrane）。

2）將混合物覆蓋在膜表面，1-2分鐘，搖晃使均勻。

3）用保鮮膜把膜包起來，放入夾板中。

4）在暗室中將X光片，覆蓋在膜的上面，夾好夾子，曝光1min。

5）顯影、定影。

6）根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時間和曝光區(qū)域，得到*結(jié)果。

注意：熒光在一段時間后會越來越弱。ELISA試劑盒

2.DAB顯色

DAB（3,3二氨基聯(lián)苯胺）和HRP反應(yīng)產(chǎn)生棕色的不溶終產(chǎn)物。這種棕色沉淀不溶于酒精和其它有機溶劑，對于必需使用傳統(tǒng)復(fù)染和封固介質(zhì)的免疫組化染色應(yīng)用特別理想。

對于AP標記的二抗我們選用BCIP and NBT 顯色，它們在堿性磷酸酶（AP）作用下反應(yīng)可生成一種不溶性黑紫色沉淀的強信號。ELISA試劑盒

Western顯色

ECL靈敏度比DAB高不少