SSR簡(jiǎn)介

所有真核生物基因組中都有一類叫微衛(wèi)星（microsalite）或簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeats）的序列，它是由2-5個(gè)核苷酸首尾相連重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA序列，具有很強(qiáng)的保守性?？梢愿鶕?jù)這段序列兩邊的序列設(shè)計(jì)引物，用PCR方法擴(kuò)增出中間的SSR序列。

在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，遵循的原則與一般PCR引物的設(shè)計(jì)相同，每條引物一般為18-24個(gè)核苷酸，（G+C）%含量接近50 %（Tm為55℃左右），避免引物內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生及某個(gè)核苷酸的連續(xù)出現(xiàn)，3'末端富含GA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在100-300 bp之間。

由于SSR擴(kuò)增為特異性擴(kuò)增，相對(duì)來說，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性都較好，但由于每對(duì)引物（G+C）含量不同，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度不同，所以有必要給每對(duì)引物一個(gè)合適的擴(kuò)增條件，這一般可通過改變反應(yīng)液中Mg2+的濃度、反應(yīng)的退火溫度、延伸時(shí)間和循環(huán)指數(shù)來獲得清晰且重復(fù)性好的條帶。SSR擴(kuò)增片段?。ㄒ话阍?00 bp以下，不同材料間差異?。ㄒ话銥閹讉€(gè)bp），故通常使用聚丙烯酰胺電泳。

由于簡(jiǎn)單序列的重復(fù)次數(shù)在同一物種的不同基因型間差異很大，因此SSR是一種多態(tài)性很高的分子標(biāo)記?！?/p>

聚丙烯酰胺凝膠電泳

丙烯酰胺是一個(gè)單體，其結(jié)構(gòu)為：

通常由過硫酸胺提供并可被TEMED（N, N, N', N'-四甲基乙二胺）所穩(wěn)定的自由基可以引發(fā)一個(gè)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使丙烯酰胺單體合成長(zhǎng)鏈。雙功能基團(tuán)N, N'-亞甲雙丙烯酰胺參與聚合反應(yīng)時(shí)，鏈與鏈之間交聯(lián)成凝膠。其孔徑由鏈長(zhǎng)和交聯(lián)度所決定。鏈長(zhǎng)由聚合反應(yīng)中丙烯酰胺的濃度（3.5-20%）所決定：每29個(gè)丙烯酰胺單體可形成1分子的交聯(lián)體。

聚丙烯酰胺凝膠的制備和電泳都比瓊脂糖凝膠費(fèi)事。聚丙烯酰胺凝膠幾乎總是鋪于兩塊玻璃板之間，兩塊玻璃板由間隔片隔開并封以絕緣物，在這種配置形式下，大多數(shù)丙烯酰胺溶液不會(huì)與空氣接觸，所以氧對(duì)聚合的抑制于凝膠頂部的一個(gè)窄層里。聚丙烯酰胺凝膠一律是進(jìn)行垂直電泳，根據(jù)分離的需要，其長(zhǎng)度可以在10-100cm之間。聚丙烯酰胺凝膠與瓊脂糖凝膠相比有3個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)：1）分辨率很強(qiáng)，長(zhǎng)度僅僅相差0.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分開；2）所能裝載的DNA量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠：多達(dá)10μg的DNA可以加樣聚丙烯酰胺凝膠的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品槽而不致顯著影響分辨力；3）從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度很高，可適用于要求zui高的實(shí)驗(yàn)。
主要試劑
1、SSR引物（從公司購得）
2、10×PCR Buffer、25 mM MgCl2、2.5 mM dNTP、Taq DNA聚合酶（5U/μL）、dd H2O
Taq DNA聚合酶購自TaKaRa，其余試劑附送。
3、40%丙烯酰胺（100mL）： 38g丙烯酰胺
2g N, N'-亞甲雙丙烯酰胺
加dd.H2O定容，37℃攪拌溶解，室溫避光保存。
4、過硫酸胺10% （10mL）： 1g過硫酸胺溶于10 mLdd.H2O中，4℃保存。
5、5×TBE（1000mL）： 54g Tris堿，27.5g硼酸，20mL 0.5mol/L EDTA （pH8.0）
6、6×上樣緩沖液（100mL）： 2.5g溴酚藍(lán)
2.5g二甲苯青FF
40g蔗糖
加dd.H2O定容，37℃攪拌溶解。4℃保存。
7、瓊脂糖
8、EB染色液

實(shí)驗(yàn)步驟
一、SSR擴(kuò)增
1、模板稀釋
取2μL定好量的DNA原液，加入38 μL dd H2O，輕輕吸打混勻。
2、反應(yīng)混合液配制
在0.5mL Eppendorf管中加入下列試劑：

稀釋DNA 2 μL
primer 各0.5 μL
10×PCR Buffer 2.5 μL
dNTP 2 μL
MgCl2 1.5 μL
Taq酶 0.2 μL
加dd H20至總體積 25 μL
加完樣后，加一滴石蠟油，離心混勻。放入PCR儀，蓋好蓋子。
3、SSR擴(kuò)增程序
94℃ 3 min
94℃ 30sec
Tm （ 48-65℃） 50sec 40cycles （退火溫度視引物而定）
72℃ 1 min
72℃ 7 min
反應(yīng)結(jié)束后，取出10 μL左右用于電泳檢測(cè)。
二、電泳檢測(cè)
1、安裝膠模
將準(zhǔn)備灌膠的玻璃板、間隔片、梳子等，用去污劑洗滌，自來水沖洗，涼干，酒精檫拭。按要求組裝好灌膠裝置。
2、配制丙烯酰胺溶液
根據(jù)所用玻璃板的大小和間隔片的厚度，估計(jì)所需丙烯酰胺溶液的體積。不同濃度的膠各成分配比如下表（總體積100 mL）：
試劑                                              配制不同濃度凝膠所用試劑的體積
                                                        3.5% 5.0% 8.0% 12.0% 20.0%
40%丙烯酰胺（mL）                      8.7 12.5 19.9 30.0 50.0
dd.H2O（mL）                                    70.6 66.8 59.4 49.3 29.3
5×TBE（mL）                                      20 20 20 20 20
10%過硫酸胺（mL）                                0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
TEMED（mL）                                         35 35 35 35 35
3、灌膠
將配制好的溶液倒入膠模，速度均勻流暢，防止引入氣泡。將玻璃板斜靠、靜置，小心插入梳子，等其凝固。檢查膠液是否流出。
4、丙烯酰胺的聚合
30-60分鐘后，觀察膠液是否聚合。聚合完后，在梳子下方可以看見折射不同的紋線。
5、拔梳子
用1×TBE浸潤凝膠的頂端2-4分鐘，小心拔出梳子。立即用1×TBE沖洗一下加樣孔，以防止梳子所留存的少量丙烯酰胺溶液在加樣孔聚合，產(chǎn)生不平整的表面。
6、凝膠的裝載
將膠模夾在電泳槽上，膠模與電泳槽接觸的邊緣用熱瓊脂糖（50℃左右）封邊。
7、加入電泳緩沖液
在電泳槽內(nèi)加滿1×TBE溶液。用灣頭吸管或注射器排除氣泡。
8、加樣
用吸管吹打，使加樣孔整齊劃一。用小移液槍頭或注射器針頭加入PCR反應(yīng)產(chǎn)物（已加過上樣緩沖液）。
9、電泳
接好電極，以1-8V/cm電泳。
10、紫外檢測(cè)
電泳結(jié)束后，小心取出膠板，放入0.5 mg/mL的EB溶液中，室溫染色15分鐘。在紫外燈下檢測(cè)DNA條帶。記錄其多態(tài)。
結(jié)果分析
每個(gè)擴(kuò)增樣品會(huì)呈現(xiàn)若干條帶，分子量大小一般為幾百bp。
同一模板，不同引物擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果往往不同。
同一引物，不同模板擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果往往不同。
實(shí)驗(yàn)中要調(diào)整退火溫度、模板用量、反應(yīng)時(shí)間等條件，以達(dá)到的擴(kuò)增效果。
小心使用丙烯酰胺、EB等有害物質(zhì)，禁止污染。