1. 基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別
1.1 基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)：
a.分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。
b.穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的試劑盒效期只有3-4 個(gè)月，采用基因工程抗原后效期大大延長(zhǎng)了。
c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。
d.純化難度大。基因工程抗原的純化技術(shù)難度較大。
1.2 合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點(diǎn)：
a.分子量太小
b.一般只含有一個(gè)抗原決定簇
c.純度高
d.穩(wěn)定性差
由于基因工程抗原較于合成肽抗原有*的*性，ELISA 診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過(guò)渡。就HCV ELISA 試劑盒來(lái)講，*代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要是HCV 特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當(dāng)時(shí)的基因工程抗原不全，僅包括了HCV 的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV 特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提高了。
由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來(lái)衡量ELISA 反應(yīng)試劑盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學(xué)敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問(wèn)題。值得欣慰的是也有廠家堅(jiān)持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)得對(duì)待反應(yīng)結(jié)果。
2．假陽(yáng)性本底產(chǎn)生的原因
2. 1 抗原因素
2.1. 1 融合蛋白對(duì)基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為例為例，因?yàn)榘坏幕蚬こ炭乖瓰槿诤系鞍祝藖?lái)自表達(dá)載體的一些序列，因此可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了可疑標(biāo)本。
2.1.2 錯(cuò)誤排序的影響。合成肽在制備過(guò)程中，如果某些肽序列錯(cuò)誤，會(huì)導(dǎo)致合成肽特異性改變而產(chǎn)生假陽(yáng)性。另外，在構(gòu)建基因工程表達(dá)載體時(shí)引入的HCV 核苷酸發(fā)生相位改變或點(diǎn)突變也會(huì)對(duì)抗原的特異性產(chǎn)生不利的影響，但由于基因工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，由工藝原因造成的抗原特異性降低會(huì)逐漸被克服。
2.2. 3 抗原純度對(duì)特異性的影響。以HCV 抗原為例，利用大腸桿菌大規(guī)模表達(dá)后需經(jīng)破碎細(xì)胞、鹽析、粒子交換柱等分離純化步驟才能zui后的到一定純度的HCV 抗原。目前的工藝還不能做到抗原純度為100％，因此抗原中還混有大腸桿菌的其它雜蛋白，受過(guò)大腸桿菌感染的人，血清中的抗大腸桿菌抗體可和這些雜蛋白產(chǎn)生反應(yīng)而引起假陽(yáng)性。
2.2 人血清中的正常IgG
人血清中IgG 的濃度對(duì)HCV 試劑盒有較大的影響。HCV 試劑盒采用的間接法，酶標(biāo)抗抗體能與人所有IgG 結(jié)合，而IgG 吸附于板孔的能力很強(qiáng)，因此我們采用100 微升樣稀加10 微升血清來(lái)將其稀釋以降低本底。到成人時(shí)，據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)調(diào)查，成人的IgG 為12mg/ml，而有些人的IgG 濃度會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于此，這部分人的血清經(jīng)ELISA 反應(yīng)后往往會(huì)顯色。
2.3 人血情中異常的IgG
結(jié)締組織?。ㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性骨髓瘤等）等病癥時(shí)，血清中的風(fēng)濕小體和其它異常IgG（IgG 濃度達(dá)到50mg/ml）會(huì)引起本底升高或假陽(yáng)性。
2.4 溶血的影響
當(dāng)溶血時(shí)，紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶的性質(zhì)，當(dāng)其通過(guò)吸附或“PP 效應(yīng)”（蛋白質(zhì)間相互吸附的現(xiàn)象）結(jié)合后，可催化A、B 液顯色而造成假陽(yáng)性。
2.5 操作不當(dāng)引起
任何操作不當(dāng)都會(huì)影響結(jié)果，因此在操作過(guò)程中保證操作的規(guī)范，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行是得到準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。
2.5.1 加樣
2.5.1.1 樣品稀釋液少加，或血清多加，都會(huì)引起本底增高。對(duì)于間接法來(lái)說(shuō)，受上述兩個(gè)因素影響更大。因?yàn)檠逯惺軝z的特異性IgG 只占總IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG 可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異的IgG均可以和酶標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)而造成較高陰性本底或假陽(yáng)性。如果加入的血清過(guò)多，高于規(guī)定的稀釋倍數(shù)，必將帶來(lái)陰性高值。
2.5.1.2 酶結(jié)合物的不正確加入。一般來(lái)講，酶也有一定的非特異吸附，將包被好的酶聯(lián)板再封閉，一方面也可避免酶的非特異性吸附。通常每孔加入的封閉液為120μl。如果加入的酶多于120μl 或加在較高的孔壁上或孔口，也會(huì)引起本底升高或假陽(yáng)性。
2.5.2 溫育
5.2.1 由于試劑盒確定的一定溫度下的反應(yīng)時(shí)間并不是反應(yīng)的終點(diǎn)，升高反應(yīng)的溫度，會(huì)加快反應(yīng)，同樣增加時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)反應(yīng)，這樣得到的反應(yīng)程度會(huì)比試劑盒確定的反應(yīng)程度多，也會(huì)引起陰性高值或假陽(yáng)性。
5.2.2 由于試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為37 度，在這個(gè)溫度下放置30 分鐘，蒸發(fā)的水分會(huì)很多，對(duì)于整個(gè)反應(yīng)體系來(lái)講，各種反應(yīng)物的濃度會(huì)不斷增加，這樣必會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)zui后的值升高。因此溫育時(shí)應(yīng)蓋上膠貼。
5.2.3 試劑盒在設(shè)計(jì)時(shí)，反應(yīng)是在靜置條件下完成的，如果反應(yīng)改變?yōu)檎駝?dòng)條件，會(huì)加快分子的熱運(yùn)動(dòng)，增加反應(yīng)的機(jī)會(huì)。
5.2.4 試劑盒的溫育過(guò)程是在培養(yǎng)箱中進(jìn)行，這和水浴的條件不一樣。水浴可是酶聯(lián)板迅速升溫，但較難將溫度控制在較穩(wěn)定的溫度，往往高于37 度，同樣會(huì)引起高值陰性。
2.5.3.洗板
2.5.3.1 各個(gè)廠家使用的洗液配方是不同的，是根據(jù)各自試劑的條件配制的，采用不配套的洗液常會(huì)得到不正常的反應(yīng)結(jié)果，包括本底過(guò)高。本公司的洗液采用*的洗滌系統(tǒng)不能和其它公司的試劑盒混用。
2.5.3.2 試劑盒中提供的洗液是濃縮的，應(yīng)該稀釋到規(guī)定的倍數(shù)使用，過(guò)多稀釋洗液，會(huì)影響洗液的效果，而使反應(yīng)的本底過(guò)高。
2.5.3.3 稀釋洗液的水應(yīng)該是新鮮的蒸餾水，電導(dǎo)率小于1.2μs。如果水中含有過(guò)多的Ca2+、Mg2+，這些離子會(huì)占用表面活性劑，影響洗滌效果。
2.5.3.4 洗板時(shí)，應(yīng)每孔加滿洗液，如果加入的洗液液量不夠，對(duì)洗滌的效果影響也是很大的。本公司的酶聯(lián)板板孔為400μl，比別的廠家的板孔大，因此洗了別公司的板后要及時(shí)調(diào)整液量，以避免加液量不滿。
2.5.3.5 洗板的次數(shù)不夠孔內(nèi)多余的抗原（抗體）或酶結(jié)合物不能*去除，也會(huì)因此本底升高。
2.5.3.6 洗板的強(qiáng)度和洗板的浸泡時(shí)間是密切相關(guān)的。洗板機(jī)不同，使用的泵不同，液體加入時(shí)的沖力不同。如果加入洗液的沖力不大，也沒(méi)有設(shè)定浸泡時(shí)間，同樣會(huì)使結(jié)果的A 值偏高。
2.5.3.7 洗板完畢后，要進(jìn)行拍板，盡量采用質(zhì)量好的毛巾和吸水紙，使用易掉渣的紙，紙屑會(huì)留在板孔中，由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。
2.5.4 顯色。加A、B 液準(zhǔn)確，順序不能顛倒，要及時(shí)終止顯色。終止后要在3 分鐘內(nèi)讀數(shù)，否則強(qiáng)陽(yáng)性會(huì)變低。
2.5.5.槍頭、加樣槽或其它來(lái)源的污染
如果使用的槍頭、加樣槽是反復(fù)使用的，必須肯定其沒(méi)有來(lái)自酶或陽(yáng)性的污染。酶作為反應(yīng)的催化劑，及其微量也會(huì)很明顯影響反應(yīng)。反復(fù)使用的槍頭、加樣槽清洗不當(dāng)，也會(huì)干擾反應(yīng)。如將槍頭使用84 消毒液浸泡而沒(méi)有沖洗干凈，因?yàn)?4 是強(qiáng)氧化劑，加入AB 液后就會(huì)顯色。同樣槍頭和加樣槽不正確清洗，改變加入試劑的PH 值，反應(yīng)的結(jié)果也會(huì)不正常。常常有人用手紙將加樣槽擦干，但是如果使用的手紙容易掉渣，會(huì)將紙上的強(qiáng)氧化劑留在槽中而影響反應(yīng)。
2.5.6.測(cè)A 值時(shí)，微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面都可能引起A 值的升高。