腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)：

腫瘤標(biāo)志物包括傳統(tǒng)的大分子標(biāo)志物（主要是大分子蛋白質(zhì)）和基因標(biāo)志物,大分子蛋白質(zhì)以抗體為基礎(chǔ)進(jìn)行IHC或蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測(cè);基因標(biāo)志物主要用RT-PCR檢測(cè).目前針對(duì)腫瘤檢測(cè)的標(biāo)志物主要有2類(lèi):
　　一是腫瘤特異性標(biāo)志物,指腫瘤細(xì)胞所*的抗原或基因,特點(diǎn)是特異性強(qiáng),但大多數(shù)實(shí)體瘤缺乏特異性腫瘤標(biāo)志物,因而臨床上很難實(shí)際應(yīng)用.二是組織特異性標(biāo)志物,指腫瘤細(xì)胞的某種成分或表達(dá)產(chǎn)物在不同組織中有差異的分布,即通過(guò)檢測(cè)某些上皮或腫瘤相關(guān)基因的表達(dá),如CK, AFP,CEA,端粒酶等作為判斷癌細(xì)胞存在的依據(jù),特點(diǎn)是敏感性高,有一定的特異性,可以穩(wěn)定地被檢測(cè)到,易于臨床上廣泛應(yīng)用,但特異性仍不夠滿(mǎn)意,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性,如上皮來(lái)源的癌細(xì)胞和某些分化早期的造血細(xì)胞均表達(dá)CK一19和端粒酶,表面抗體與前體細(xì)胞（成紅細(xì)胞,幼紅細(xì)胞,原始粒細(xì)胞）易出現(xiàn)交叉反應(yīng)等.所以選擇合適的標(biāo)志物對(duì)提高微轉(zhuǎn)移的檢出率很有意義.下面就一些常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)志物作一下綜述.
　　1.細(xì)胞角蛋白（cytokeratins, CKs） CK起源于上皮細(xì)胞,是上皮細(xì)胞和上皮來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞中間絲的組成成分,包括至少20種相關(guān)多膚的多基因家族,分為酸性細(xì)胞角蛋白（I T!,CK10-20）和堿性細(xì)胞角蛋白（II型,CK1 -9）兩個(gè)亞家族,CK是上皮分化的zui可靠標(biāo)記物,對(duì)上皮組織的定性具有*的價(jià)值.而血液,淋巴結(jié),骨髓組織屬于結(jié)締組織,CK在這些組織中不表達(dá),故CK系列被認(rèn)為是檢測(cè)循環(huán)癌細(xì)胞的敏感標(biāo)記物.其中以CK家族中zui小的成員CK一19的表達(dá)zui為特異,從已有資料看,表現(xiàn)出較高的靈敏度（90%一100%）和特異性（98%一100%）.Aihara等〔''）應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)胰腺癌和胃癌患者外周血及術(shù)中門(mén)靜脈血中CK一19 mRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)腫瘤分期越晚,血循環(huán)中微轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性率也越高,提示檢測(cè)外周血中的微轉(zhuǎn)移癌有助于提高分期準(zhǔn)確性,幫助判斷預(yù)后,并證明CK一19 mRNA是診斷循環(huán)性腫瘤細(xì)胞很有價(jià)值的標(biāo)志物.CK20是MOLL等1990年發(fā)現(xiàn)并分離的,分子量46, 000, DNA總長(zhǎng)度為18kb,含8個(gè)外顯子,7個(gè)內(nèi)含子,其mRNA長(zhǎng)1.75 kb, Moll等又于1992年制備出CK20的一系列單克隆抗體,為C K20的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).CK20有更嚴(yán)格的特異性上皮分布,主要分布于胃腸道勃膜上皮細(xì)胞,泌尿道傘狀細(xì)胞,表皮Merk細(xì)胞,舌味蕾細(xì)胞上.在人類(lèi)腫瘤中,不同型癌CK20的表達(dá)有較大差異.結(jié)腸癌,胃腺癌,卵巢粘液腺癌,泌尿道移行細(xì)胞癌,膽囊和膽管腺癌,胰管細(xì)胞癌中CK20陽(yáng)性,而在腎細(xì)胞癌,小細(xì)胞肺癌,子宮內(nèi)膜癌,乳腺癌中CK20陰,t.由于CK20具有不同于其它I型細(xì)胞角蛋白的特點(diǎn),使CK20成為一種新的診斷標(biāo)志物,且可通過(guò)目前的試驗(yàn)技術(shù)去除正常細(xì)胞的干擾.

　2.癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）和癌胚抗原信使核糖核酸（carcinoembryonic antigen RNA, CEA mR-NA） CEA是一種胃腸道腫瘤細(xì)胞以及某些幼稚細(xì)胞合成的蛋白質(zhì),可被腫瘤細(xì)胞分泌于血液內(nèi)和腹水內(nèi),檢測(cè)CEA萬(wàn)方數(shù)據(jù)210對(duì)消化系統(tǒng)惡性腫瘤的特異性較高,常應(yīng)用于消化系統(tǒng)腫瘤的輔助診斷及惡性腹水的鑒別診斷,各因素分析證明CEA作為一種預(yù)測(cè)胃腸道癌腹膜轉(zhuǎn)移指標(biāo)優(yōu)于經(jīng)典的腫瘤TNM分期及細(xì)胞學(xué)檢測(cè)系統(tǒng).但CEA指標(biāo)陽(yáng)性率較低,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CEA變化對(duì)判斷療效和轉(zhuǎn)歸則有較好的應(yīng)用價(jià)值.近年來(lái),采用RT一PCR技術(shù)篩查腫瘤相關(guān)mRNA用于微轉(zhuǎn)移的檢測(cè),顯示出很好的特異性和高敏感性.CEA mRNA幾乎只存在于某些腫瘤細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞外不存在游離CEA mRNA,因此在血循環(huán),骨髓,淋巴結(jié)及胸,腹水等內(nèi)檢測(cè)到CEA mR-NA,則提示發(fā)生了能表達(dá)CEA mRNA的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)
移[[8-to].徐惠錦,王劍鋒等〔''",川對(duì)胃癌腹腔沖洗液進(jìn)行CEA mRNA的RT一PCR檢查,與腹腔液中CEA （ peritonealCEA, p-CEA）和腹腔沖洗液細(xì)胞學(xué)檢查（peritoneal lavagecytology., PLC）比較,前者陽(yáng)性表達(dá)率（55.8%）明顯高于后二者（37.2%和32.6%）,顯示了較高的敏感性,且與胃癌浸潤(rùn)深度,漿膜受侵程度和類(lèi)型相一致,與對(duì)照組比較亦顯示較好的特異性.Yone mura等扛1z〕指出腹腔細(xì)胞學(xué)和RT -PCR檢查結(jié)果獨(dú)立地與腹腔復(fù)發(fā)有關(guān),而灌洗液中CEA水平則無(wú)關(guān),腹腔細(xì)胞學(xué)檢查是zui有意義的預(yù)測(cè)方法.聯(lián)合應(yīng)用CEA RT一PCR和細(xì)胞學(xué)方法可提高對(duì)腹腔復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè).Castaldo等用RT一PCR和dot-blot分析方法對(duì)外周血中CEA表達(dá)情況的研究顯示,健康志愿者,有明確轉(zhuǎn)移者,無(wú)明確轉(zhuǎn)移者的腫瘤患者中,CEA陽(yáng)性表達(dá)率分別是.（0/16）,80%（8/10）和28.6（4/14）,,顯示了較好的特異性.Mori等檢測(cè)55例消化道腫瘤及乳腺癌患者外周血CEA mRNA,結(jié)果對(duì)照組陰性,41例行*術(shù)患者中11例（27%）陽(yáng)性,已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的14例中9例陽(yáng)性,并認(rèn)為多次采血癌細(xì)胞間斷進(jìn)人血循環(huán)可能提高陽(yáng)性率.因此,及時(shí)發(fā)現(xiàn)外周靜脈血微轉(zhuǎn)移灶的存在,進(jìn)行針對(duì)性的輔助化療非常重要.

　　3.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growthfactor, VEGF）瘤內(nèi)新生血管形成是腫瘤迅速增長(zhǎng),侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵.VEGF是一種堿性可分泌的肝素結(jié)合蛋白,是比較重要和有特性的促進(jìn)血管內(nèi)皮及細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子,其編碼基因位于6p21. 3,有8個(gè)外顯子,由于mRNA不同的剪切形成,形成5種VEGF,其中以VEGF165zui重要,其次為VEGF121,VEGF145,VEGFI89,而VEGF206非常少見(jiàn).它能通過(guò)與受體作用,一方面促使微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,遷移,另一方面促進(jìn)微血管通透性增加,被認(rèn)為是血管新生的重要啟動(dòng)子.VEGF作為一種特異的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原,調(diào)控腫瘤的血管形成,新生血管的結(jié)構(gòu)和功能異常,也有利于腫瘤細(xì)胞逃逸導(dǎo)致發(fā)生轉(zhuǎn)移,具有血管生成能力的腫瘤細(xì)胞更易在轉(zhuǎn)移灶處存活和發(fā)展.通常采用ELISA法,免疫組化或RT一PCR方法等檢測(cè)血清（或血漿）及癌組織中的VEGF,
VEGF受體或VEGF mRNA.研究發(fā)現(xiàn),腫瘤患者的VEGF表達(dá)異常,比健康人明顯升高,癌組織中的VEG F表達(dá)顯著高于良性及正常組織.癌組織中VEG F表達(dá)陽(yáng)性者的微血管密度（microvessel densitY, MVD）顯著高于陰性者,而MVD計(jì)數(shù)與腫瘤大小和浸潤(rùn)深度密切相關(guān),在多種人類(lèi)腫瘤中,腫瘤類(lèi)MVD被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的一個(gè)較可靠的預(yù)測(cè)指標(biāo),原發(fā)瘤內(nèi)MVD高者腫瘤的轉(zhuǎn)移率高["〕.許多文獻(xiàn)報(bào)道``0,''5} , VEGF水平與腫瘤臨床分期,局部侵襲深度,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均有密切關(guān)系,高水平VEGF患者對(duì)化療不敏感,復(fù)發(fā)率高,生存期短,生存率低.不少作者認(rèn)為血清VEGF可成為預(yù)測(cè)復(fù)發(fā),轉(zhuǎn)移及預(yù)后的有價(jià)值的獨(dú)立因素.但也有研究表明,單一VEGF成為預(yù)測(cè)預(yù)后指標(biāo)是不足.腫瘤血管形成是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程,VEGF與其他生物學(xué)指標(biāo)有共同和相互作用.董強(qiáng)剛等研究發(fā)現(xiàn),只有在血循環(huán)癌細(xì)胞陽(yáng)性的患者,VEGF與癌細(xì)胞含量之間才存在相關(guān)性,而在癌細(xì)胞陰性患者中,VEGF含量高低似乎對(duì)其血道轉(zhuǎn)移無(wú)影響,此研究提示癌細(xì)胞的血道轉(zhuǎn)移可能受某些轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的控制,此類(lèi)基因控制細(xì)胞增殖,凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular Matrix, ECM）蛋白的水解等,其一旦失活（或表達(dá)）,癌細(xì)胞就獲得了轉(zhuǎn)移的潛能,VEGF促使這類(lèi)具有轉(zhuǎn)移潛能的癌細(xì)胞加快進(jìn)人血循環(huán)[''〕.

　4.基質(zhì)金屬蛋白酶（ Matrix metalloproteinase, MMPs）MMPs是一類(lèi)鋅離子依賴(lài)的催化ECM降解的重要蛋白水解酶,MMPs家族至今已發(fā)現(xiàn)有20多種成員,分為膠原酶（MMP-1,8,13）,基質(zhì)溶解素（MMP-3,10,11）,明膠酶（MMP-2,9）,膜型金屬蛋白酶（MT-MMP）及彈力蛋白酶（MMP-12 ）等5類(lèi).MMPs在多種惡性腫瘤中表達(dá)增高,腫瘤的間質(zhì)中也有表達(dá),提示MMPs與腫瘤的侵襲,轉(zhuǎn)移有關(guān).MMPs破壞局部組織結(jié)構(gòu),促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng);破壞基底膜屏障,利于腫瘤轉(zhuǎn)移;通過(guò)對(duì)ECM的改建,促進(jìn)腫瘤新生血管形成.而金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMP ）則可抑制這個(gè)過(guò)程.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MMP-2表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移表型有關(guān),被認(rèn)為是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的必需條件.MMP一能特異性降解明膠及膠原,在腫瘤細(xì)胞侵襲穿透基底膜的過(guò)程中起著重要的作用.Westerlund等[16〕采用免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)MMP一表達(dá)與惡性腫瘤的復(fù)發(fā)密切相關(guān),其中復(fù)發(fā)患者表達(dá)率為83%,表達(dá)MMP-2的患者較不表達(dá)者易復(fù)發(fā)（P<0.05）.腫瘤間質(zhì)中表達(dá)MMP一與轉(zhuǎn)移有關(guān),陽(yáng)性表達(dá)者53%發(fā)生轉(zhuǎn)移,且惡性腫瘤中MMP一表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān).蔡威等["]用免疫組化,p法檢測(cè)卵巢囊腺瘤及卵巢癌組織的MMP-2, MMP一及其組織抑制物TIMP-2的表達(dá),結(jié)果提示三者在卵巢癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于卵巢囊腺瘤,與卵巢癌的臨床分期,病理分級(jí)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),MMP-2,MMP一蛋白高表達(dá),可作為卵巢癌具有轉(zhuǎn)移傾向的臨床參考指標(biāo).

　5.其他癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志物薪蛋白（MUC1）基因也是一種上皮組織特異性標(biāo)志物,編碼上皮組織細(xì)胞膜上粘蛋白的核心蛋白,在正常外周血,骨髓及淋巴結(jié)中無(wú)MUCl表達(dá),若在這些非上皮組織中檢測(cè)到MUCl,就提示癌組織的存在。因此,檢測(cè)CAMs對(duì)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移也具有重要的意義.

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素,多階段,多步驟的復(fù)雜過(guò)程,因此對(duì)腫瘤微轉(zhuǎn)移的研究也是一項(xiàng)復(fù)雜的工程.這項(xiàng)工作還剛剛開(kāi)始,有待深人開(kāi)展,對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腫瘤,克服腫瘤必將提供有力的幫助。