PK-15細(xì)胞低血清培養(yǎng)：

一、 PK-15細(xì)胞的特點(diǎn)及用途

1. PK-15系豬腎細(xì)胞（pig kidney），體外培養(yǎng)呈上皮樣貼壁型細(xì)胞；

2.該細(xì)胞對多種病毒比較敏感，如豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）等，可應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒疫苗、豬細(xì)小病毒疫苗、豬瘟病毒疫苗等的制備。

3.目前培養(yǎng)PK-15細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的主要是轉(zhuǎn)瓶工藝，培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM、199或MEM+10%小牛血清。

4.該細(xì)胞較易適應(yīng)低血清培養(yǎng)，并有不同的克隆，血清使用量可降低至3-5%。

二、PK-15細(xì)胞低血清培養(yǎng)

1、細(xì)胞形態(tài)

在方瓶中使用低血清培養(yǎng)基（MD611）逐代降低血清使用量，進(jìn)行細(xì)胞的低血清馴化適應(yīng)，在低血清培養(yǎng)狀態(tài)下，細(xì)胞具有清晰的輪廓、立體感較強(qiáng)，細(xì)胞更致密，與原培養(yǎng)液的細(xì)胞形態(tài)無差異。

2、細(xì)胞增殖情況

PK-15細(xì)胞以一定接種密度（3-4×104個(gè)/cm2）接種方瓶進(jìn)行連續(xù)傳代，3d左右細(xì)胞可形成單層或致密單層，需及時(shí)傳代。如下圖所示，使用低血清培養(yǎng)基+5%NBS培養(yǎng)的細(xì)胞與DMEM+10%NBS培養(yǎng)的增殖速率基本無差別，細(xì)胞3d可增殖6-7倍，細(xì)胞數(shù)可達(dá)2×107個(gè)/T75。

三、低血清培養(yǎng)PK-15細(xì)胞的探討

1.細(xì)胞在改變培養(yǎng)環(huán)境時(shí)，如改換培養(yǎng)基、血清，包括血清批號、血清廠家、血清濃度等，細(xì)胞的培養(yǎng)情況可能會與先前培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)有所差異，此時(shí)應(yīng)注意細(xì)胞的傳代比例、分種時(shí)間等，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的生長情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。比如細(xì)胞在改變初期pH變化可能較快，應(yīng)及時(shí)對細(xì)胞進(jìn)行換液培養(yǎng)，PK-15細(xì)胞培養(yǎng)液pH一般不應(yīng)低于6.8；

2.低血清培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富，PK-15細(xì)胞代謝旺盛，因此在使用低血清培養(yǎng)基時(shí)需按照產(chǎn)品說明加入標(biāo)示量的碳酸氫鈉以維持適當(dāng)?shù)?span lang="EN-US">pH及滲透壓，有利于細(xì)胞的生長、增殖；

3. PK-15細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中比較容易適應(yīng)培養(yǎng)，血清量可間接或直接進(jìn)行降低。本實(shí)驗(yàn)室做過10%、7%、5%血清的逐代降低，細(xì)胞按照4×104/cm2密度接種，3d進(jìn)行傳代，細(xì)胞可良好適應(yīng)。

四、MD611低血清培養(yǎng)基的配制方法

MD611培養(yǎng)基不同于傳統(tǒng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的正確配制和使用方法影響細(xì)胞的培養(yǎng)效果，應(yīng)嚴(yán)格按使用說明書配制使用。以50L/包規(guī)格低血清培養(yǎng)基為例，應(yīng)按以下程序配制培養(yǎng)基。

1.打開培養(yǎng)基包裝，將培養(yǎng)基全部倒入一容器中。

2.用少量冷卻注射用水（20℃～30℃）涮洗袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基，倒入容器內(nèi)。

3.向容器中加入約40L冷卻注射用水（20℃～30℃），攪拌至培養(yǎng)基*溶解。

4.按使用說明書標(biāo)示量加入114.5克碳酸氫鈉，攪拌至*溶解，補(bǔ)加冷卻注射用水（20℃～30℃）至50L，充分混合，用pH計(jì)檢測，溶液pH應(yīng)為7.2～7.4。

5.按使用量加入血清和抗生素，混合均勻，用0.22μm濾膜正壓過濾除菌。

6.除菌后培養(yǎng)基，置2℃～8℃避光保存。

五、MD611低血清培養(yǎng)基一些注意事項(xiàng)

1.不可配制成濃縮液儲存使用。

2.不可用高壓濕熱法進(jìn)行滅菌。

3.不可冷凍儲存，再溶解使用。

4.不可常溫儲存，2～8℃儲存。

5.該培養(yǎng)基中已含谷氨酰胺，由于谷氨酰胺不穩(wěn)定，易分解，產(chǎn)生對細(xì)胞敏感的毒性物質(zhì)，故加入血清的*培養(yǎng)液應(yīng)盡快使用完畢。

6.該培養(yǎng)基中所含指示劑酚紅的量是常規(guī)量的一半，故從外觀上看所配溶液顏色較淺，判定pH時(shí)，建議用pH計(jì)測定pH。