光反應活性氨基酸交聯(lián)和甲醛交聯(lián)用于蛋白相互作用分析互補

L-光反應-亮氨酸（L-Photo-Leucine）和L-光反應-甲硫氨酸（L-Photo-Methionine）是L-亮氨酸和L-甲硫氨酸氨基酸的類似物，具有可被活化的雙吖丙啶側鏈，當暴露于紫外光照射時能夠與鄰近的分子進行化學交聯(lián)。與它們存在的對應物一樣，這些光反應活性氨基酸在蛋白合成時可以被內源性地整合到蛋白的一級序列中。這些合成的蛋白，其在環(huán)境中參與蛋白-蛋白相互作用結構域可以通過雙吖丙啶基團進行共價交聯(lián)。傳統(tǒng)的交聯(lián)實驗需要加入雙功能性化學交聯(lián)劑以及相關的試劑溶劑，它們對所要研究的細胞生物學內容有不良影響。使用光反應活性氨基酸可將這些潛在的不良影響小化，使所要研究和鑒別的細胞中的穩(wěn)定的及短暫的蛋白相互作用高度可信。當與不含亮氨酸和甲硫氨酸的配制的型細胞培養(yǎng)基聯(lián)合使用時，蛋白合成機制會將光反應活性衍生物像其存在的氨基酸進行同樣處理。因此，它們可以在蛋白一級序列中取代亮氨酸或甲硫氨酸。當暴露于紫外光（見紫外燈，下頁）時，雙吖丙啶環(huán)形成有活性的反應中間體，與鄰近蛋白的側鏈和骨架形成共價鍵。關聯(lián)結合的配體便立即被捕獲。交聯(lián)的蛋白復合體通過在SDS–PAGE 中遷移率降低而被檢測，隨后進行Western blot 檢測，分子排阻色譜，蔗糖密度梯度沉降或質譜檢測。

光反應活性氨基酸交聯(lián)和甲醛交聯(lián)是用于蛋白相互作用分析的互補。Hela細胞進行模擬處理（1道），使用1%甲醛處理10 分鐘（2道），或使用光-甲硫氨酸和光-亮氨酸處理后進行紫外線處理（3道）。細胞裂解后每個樣品取10μg 進行SDS-PAGE和Western blotting分析，使用抗hsp90，STAT3，Ku70 和Ku86抗體。以β-actin和GAPDH印跡作為上樣對照。

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小編：wyf  2020.10.29