標簽：熒光多色標記試劑盒 檢測試劑盒 ELISA試劑盒

　　古朵技術詳解：熒光多色標記試劑盒(六標七色)

　　原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶( HRP) 對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法， 類似常規(guī)免疫組化的 DAB 顯色方法，TSA 技術同樣采 用 HRP 標記的二抗，同樣有對應的“顯色"步驟 (HRP 催化加入反應體系的酪胺熒光素底物，產(chǎn)生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的等殘基共價結合，使樣品上穩(wěn)定的共價結合酪胺熒光素。之后用熱修復法洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP 復合物，重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵 育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復就可實現(xiàn)多重標記。

　　TSA 詳細原理是利用酪胺 Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價鍵結合位點)， 產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基結合， 這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積， 結果使其檢測信號得到 10-100 倍增強。簡單來說，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP (而不是直接偶聯(lián)熒光素) ，來催化后續(xù) 添加入體系的非活性熒光素。 熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨suan殘基 共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理，前一輪非共價 結合的抗體被洗掉，共價結合的熒光素穩(wěn)定共價結合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。 等到所有抗體孵育結束，熒光素都結合好后，最后去檢測結果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔心抗體交叉反應，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設計時不同 種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說， 如果用TSA 技術，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性 高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以進行實驗，而且信號放大的倍數(shù)大大增強。 本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種： TYR-480， TYR-520， TYR-570 ， TYR-620， TYR-690， TYR-780。 此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。 可以實現(xiàn)單標、 雙標、三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能， 極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。

　　試劑盒組成： TYR-480 熒光染料 (即用型， 5mL),-20℃; TYR-520 熒光染料(綠光)(即用型， 5mL),- 20℃; TYR-570 熒光染料 (紅光) (即用型， 5mL)， -20℃; TYR-620 熒光染料 (即用型， 5mL)， - 20℃; TYR-690 熒光染料 (即用型， 5mL)， -20℃; TYR-780 熒光染料 (即用型， 5mL)， -20℃; TSA+增強劑， 100ul， -20℃ (可選) ;

　　高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 (20mL) 4℃。

　　備注： TYR-480 熒光染料 、TYR-520 熒光染料 、TYR-570 熒光染料、 TYR-620 熒 光染料、 TYR-690 熒光染料、 TYR-780 熒光染料 在-20 度下， 均為固體， 使用之前需解凍。

　　TSA+增強劑使用方法： TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號 5-10 倍， TSA+增 強劑： TYR 熒光放大液=1:500， 使用 TSA+增強劑不是必須的選項， 可以根據(jù)具體的情況選擇添加 或者不選擇添加。

　　熒光多色標記試劑盒操作流程：

　　1、 石蠟切片脫蠟至水： 依次將切片放入二甲b Ⅰ 15min-二甲bⅡ15min-無水乙醇 Ⅰ5min-無水乙醇 Ⅱ。 取出放在通風廚內(nèi)， 酒精晾干后放入自來水中稍洗， 蒸餾水洗。

　　2、 抗原修復： 組織切片置于盛滿 PH 9.0 EDTA 堿性抗原修復液或者 PH6.0 檸檬酸修復緩沖液的修復 盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復 (也可以用高壓 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 熱修復方法) 。 中火 8min， ?；?8min， 轉中低火 7min， 此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)， 切勿 干片。 自然冷卻后將玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 (修復液 和修復條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定) 。

　　3 、 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶： 切片放入 3%過氧化氫溶ye， 室溫避光孵育 15 min， 將玻片置于 PBS (PH7.4) 中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。

　　4、 BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈 (防止抗體流走) ， 在圈內(nèi)滴加用 3%BSA-PBS (或者其他封閉液) 均勻覆蓋組織， 室溫封閉 30min。

　　5、 加一抗： 輕輕甩掉封閉液， 在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗 X， 切片平放于避光濕盒 內(nèi) 4°C 孵育過夜或者 37 度 1-2h。 (濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

　　6、 加 hrp 二抗： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次5min。 切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育 50min，PBS 洗三次。

　　7、 熒光染料反應： TYRXXX 熒光染料反應 10-15min， PBS 洗三次。

　　8、 重復 2-7 步驟 (換用另外一種 TYRXXX 熒光染料)

　　9、 DAPI 復染細胞核： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈內(nèi)滴加 DAPI 染液， 避光室溫孵育 10min。

　　10、 封片： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 熒光淬滅封片劑封片。

　　11、 鏡檢拍照： 切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖 像。

　　染料 激發(fā)波長 發(fā)射波長

　　DAPI 藍色 350 420

　　TYR-480 450 480

　　TYR-520 綠色 490 520

　　TYR-570 紅色 550 570

　　TYR-620 590 620

　　TYR-690 630 690

　　TYR-780 750 780

　　文獻引用格式： Co-staining of A, B， C， D， E and F was performed using a Seven-color multiple immunofluorescence Kit ( GuduoBio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.

　　古朵技術詳解：熒光多色標記試劑盒(六標七色)上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術相關產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發(fā)高質量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。