犬血管緊張素??(Ang ??)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒

　　本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定犬血清，血漿，細胞上清及相關(guān)液體樣本中血管緊張素??(Ang ??)的含量。

　　實驗原理：

　　本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中犬血管緊張素??(Ang ??)水平。用純化的犬血管緊張素??(Ang ??)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入血管緊張素??(Ang ??)再與HRP標記的血管緊張素??(Ang ??)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血管緊張素??(Ang ??)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中犬血管緊張素??(Ang ??)濃度。

　　試劑盒組成：

　　試劑盒組成48孔配置96孔配置保存

　　說明書1份1份

　　封板膜2片(48)2片(96)

　　密封袋1個1個

　　酶標包被板1×481×962-8℃保存

　　標準品：360ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存

　　標準品稀釋液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存

　　酶標試劑3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　樣品稀釋液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　顯色劑A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　顯色劑B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

　　濃縮洗滌液(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存

　　樣本處理及要求：

　　1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

　　2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

　　3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

　　4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

　　5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

　　6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

　　7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

　　操作步驟

　　1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻;然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為240 ng/L，160ng/L ，80ng/L，40 ng/L，20 ng/L)。

　　2. 加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

　　3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

　　4. 配液：將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用。

　　5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

　　6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

　　7. 溫育：操作同3。

　　8. 洗滌：操作同5。

　　9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

　　10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

　　11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

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