CRISPR-Cas9為基因工程領(lǐng)域打開了一扇嶄新的大門。這個相對簡單的分子生物學(xué)工具幾乎可以用來編輯任何基因組。CRISPR-Cas9 復(fù)合物由可編碼的 guide RNA (gRNA) 和 Cas9 核酸酶組成，這兩種成分結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合物（RNP），然后結(jié)合并切割目標基因，再進一步利用細胞的修復(fù)機制來實現(xiàn)基因組的編輯。

在過去的幾年里，CRISPR-Cas9 技術(shù)已經(jīng)被越來越多的研究人員所采用，并且在包括醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和疾病控制等許多領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響。

在設(shè)計 CRISPR 實驗時，gRNA 和 Cas9 的結(jié)構(gòu)是一個需要考慮的重要因素。在瞬時轉(zhuǎn)染的時候 (即成分短暫存在于細胞內(nèi))，gRNA 和 Cas9 可以用質(zhì)粒 DNA、RNA 或預(yù)先復(fù)合的 RNPs 傳遞。目前有許多研究人員傾向于選擇質(zhì)粒，因為它們便宜、易于使用，而且可以加入標記基因。然而，用質(zhì)粒表達 gRNA 和 Cas9 也存在一些問題。

在這篇文章中，我們將概述其中的一些缺陷，并指出為什么使用 RNPs 是更好的選擇的。

CRISPR 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染會增加脫靶效應(yīng)

在任何 CRISPR 實驗中，令人關(guān)注的方面之一就是在錯誤的位置切割基因組 DNA，即脫靶效應(yīng)。雖然精心設(shè)計的 gRNA 會在大多數(shù)情況下結(jié)合在正確的 DNA 位點，但是它們也可能會與只有少數(shù)錯配的序列結(jié)合。這些脫靶效應(yīng)會造成嚴重問題，因為被錯誤編輯的基因位點可能會改變表型，或是對目標細胞與有機體產(chǎn)生有害影響。

CRISPR 組成以質(zhì)粒形式導(dǎo)入常常與高水平的脫靶效應(yīng)相關(guān)。這種效應(yīng)是由于質(zhì)粒在細胞內(nèi)停留的時間相對較長，可能會持續(xù)數(shù)周。期間 gRNA 和 Cas9 會大量表達，因此有更大可能性使得 gRNA-Cas9 切割錯誤的位點。

幾項研究表明，當 CRISPR 組成成分以預(yù)先復(fù)合的 RNPs 而非質(zhì)粒 DNA 的形式傳遞時 (Liang et al. 2015, Kim et al. 2014) ，脫靶突變的頻率較低。例如，Liang 等人 (2015) 發(fā)現(xiàn)，對于 OT3-18 基因，與質(zhì)粒 DNA 相比，當使用 RNPs 時，脫靶突變與目標突變的比率降低了 28 倍。RNPs 較低的脫靶率可能與其在細胞內(nèi)活性維持時間較短相關(guān)。與質(zhì)粒不同的是，RNPs 在轉(zhuǎn)染后能迅速切割基因組 DNA，并且在細胞中只停留一天左右就被降解了 (Kim 等人 2014)。由于切割基因組 DNA 的時間更短，所以脫靶效應(yīng)也減少了。

質(zhì)粒 DNA 可能會整合到宿主基因組上

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的另一個潛在問題是質(zhì)粒 DNA 的全部或部分序列可能會隨機整合到目標細胞的基因組中。Kim 等人 (2014) 發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒導(dǎo)致的插入普遍存在于目標和非目標位點。雖然可以通過測序檢測目標位點是否存在插入片段，但確定非目標位點的插入就變得困難許多，因此應(yīng)當使用 RNPs 轉(zhuǎn)染來避免外源 DNA 整合進基因組。

RNPs 對細胞的毒性比 CRISPR 質(zhì)粒小

DNA 轉(zhuǎn)染通常會給細胞帶來生存壓力，外源 DNA 的存在可能觸發(fā)人原代細胞和多能干細胞中環(huán)化 GMP-AMP 合成酶的激活。對于這種敏感的細胞類型，使用 RNP 而不是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以降低對細胞的毒性。根據(jù) Kim 等人 (2014) 的研究，與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，RNPs 轉(zhuǎn)染至少可以產(chǎn)生 2 倍以上的有活性的胚胎干細胞集落。

質(zhì)粒表現(xiàn)出多變的 CRISPR 編輯效率

質(zhì)?？赡艽嬖谫|(zhì)量問題。當 CRISPR 組分以質(zhì)粒 DNA 的形式轉(zhuǎn)染時，在進行任何基因編輯之前，需要在細胞內(nèi)進行 gRNA 和 Cas9 轉(zhuǎn)錄與 Cas9 翻譯。這不僅延長了實驗時間，而且 gRNA 的表達或者 Cas9 的組裝和折疊有出錯的風險。使用 RNPs 則可以避免這些問題，因為 gRNA 和蛋白質(zhì)成分是在轉(zhuǎn)染之前制備的，而且 gRNA 和 Cas9 的質(zhì)量可以在它們被導(dǎo)入細胞之前得到驗證。

RNP 的另一個好處是使得 gRNA 受到 Cas9 的保護，從而降低 gRNA 降解的風險。此外，合成的 gRNA 可以進行化學(xué)修飾，以防止核酸內(nèi)切酶降解和免疫攻擊。這兩種因素都能使 gRNA 在短時間內(nèi)更有效地靶向基因組 DNA (Hendel & Bak 等人 2015)。

考慮到 RNPs 的諸多優(yōu)勢，它們在多種永生細胞、原代細胞和干細胞中都能一直保持高編輯效率也就不足為奇了，(e.g., Hendel & Bak 等 2015, Kim 等 2014, Liang 等 2015, Lin 等 2014). 此外，我們都知道通過同源定向修復(fù)機制實現(xiàn)基因敲入是一個效率極低的過程，但通過使用 RNPs 我們可以提升這一過程的效率。(Gaj 等 2017, Lin 等 2014, Schumann 等 2015).

用 RNPs 代替質(zhì)粒來做 CRISPR 值得嗎？

當嘗試用 RNPs 替換質(zhì)粒時，你可能仍然在想質(zhì)粒的一些優(yōu)點，比如，它們很便宜。但問問你自己，這些所謂的優(yōu)點真的值得你在你的細胞中引入更多的脫靶編輯嗎? 或者甚至是將外源 DNA 整合進你的細胞賴以生存的必需基因中? 有些人或許會認為，質(zhì)粒中可以加入標記基因 (如抗生素基因) 是一種*的優(yōu)勢，因為它能使你富集被轉(zhuǎn)染的細胞。然而，由于使用 RNPs 通常會讓你的編輯效率超過 70%，所以向質(zhì)粒中加入標記基因變得*不必要了?？紤]到這些因素，你應(yīng)該明白 RNPs 的好處已經(jīng)遠遠超過其成本了。從今天起，讓 RNPs 成為你得心應(yīng)手的 CRISPR 工具吧！

參考文獻 

Gaj T. et al. 2017. Targeted gene knock-in by homology-directed genome editing using Cas9 ribonucleoprotein and AAV donor delivery. Nucleic Acids Research 45(11):e98.
Hendel A and Bak RO et al. 2015. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nature Biotechnology 33:985–989.
Kim S et al. 2014. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research 24:1012–1019.
Liang X et al. 2015. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology 208: 44–53.
Lin S et al. 2014. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, e04766-e04766.
Schumann K et al. 2015. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442.