蛋白過鎳柱純化的原理：Ni-NTA 純化介質(zhì)純化帶有 His6-Tag 的融合蛋白是目前蛋白純化中常使用的一種方法。Ni 柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有 HIs(組蛋白) 標(biāo)簽的堿性蛋白蛋白結(jié)合，組蛋白標(biāo)簽一般是 6 個(gè)組氨酸 (堿性氨基酸)。在蛋白上樣后，帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni 柱中的氯化鎳或者硫酸鎳也可以與咪唑結(jié)合，采用咪唑洗脫，咪唑競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到硫酸鎳上，目的蛋白就被洗脫了，這時(shí)候收集穿出液，里面就是目的蛋白，然后透析掉咪唑即可。 上樣，清洗，洗脫，基本三個(gè)步驟就結(jié)束了。

Ni-NTA 常見問題及建議

1. His 標(biāo)簽蛋白沒有與柱結(jié)合：

a. 可能原因：超聲的功率不對(duì) ( 太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒有釋放)。 解決方法：改變超聲功率，并在超聲前加入溶菌酶。

b. 可能原因：樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確。 解決方法：檢測(cè) pH 及樣品和結(jié)合緩沖液的組成份。確保在溶液中鰲合劑或強(qiáng)還原劑的濃度及咪唑的濃度不是太高。

c. 可能原因：組氨酸標(biāo)簽暴露不*。 解決方法：在變性條件下 ( 用 4-8 M 脲，或 4-6 M 鹽酸胍) 進(jìn)行純化。

d. 可能原因：His 標(biāo)簽丟失。 解決方法 1：WB 檢查 His 是否表達(dá)，上游構(gòu)建，改變 His-tag 的位置 (C- 端或 N- 端)，必要時(shí)增加 His 個(gè)數(shù)。 解決方法 2：孵育的時(shí)間不夠，降低流速和增加孵育的時(shí)間。

解決方法 3：改變螯合的金屬離子，尋找到*的結(jié)合金屬離子。 Ni2+ 通常是從宿主細(xì)胞蛋白中純化大多數(shù) 6×His 標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的shou選金屬離子。也是一般常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結(jié)合強(qiáng)度受幾種因素影響，包括長(zhǎng)度、位置、親和標(biāo)記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的 pH，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進(jìn)行純化而不用 Ni2+。 2. His 標(biāo)簽蛋白沒有被洗脫下來：

a. 可能原因：洗脫條件太溫和 （組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上，結(jié)合力較強(qiáng)）。 解決方法：增加咪唑的梯度洗脫或降低 pH 來找出*的洗脫條件。

b. 可能原因：降低 pH 的方法洗脫的，若 pH 低于 3.5，會(huì)導(dǎo)致鎳離子脫落。 解決方法：改變洗脫辦法，咪唑競(jìng)爭(zhēng)性洗脫。

c. 可能原因：蛋白已沉淀在柱上。 解決方法： 減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變 NaCl 的濃度，或在變性條件 ( 去折疊) 下洗脫 ( 用 4～8 M 脲，或 4～6 M 鹽酸胍)。

d. 可能原因：非特異性疏水或其他相互反應(yīng)。 解決方法：加非離子去污劑到洗脫緩沖液 (如：2% Triton X-100) 或增加 NaCl 的濃度。 3. His 標(biāo)簽蛋白洗脫后雜帶較多