ELISA實驗注意事項以及常見問題解答

　　酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)被稱為免疫測定金標準。是一種免疫學測定方法。ELISA是用于測定抗原抗體，根據(jù)樣本不同的類型和檢測方法來進行相應(yīng)的制定。主要類型有雙抗體夾心法、間接法、競爭法、雙抗原夾心法。

　　雙抗體夾心法是常用的ELISA檢測類型，它是利用一個抗體進行捕獲，另外一個抗體進行檢測。雙抗體夾心法具有高特異性和高靈敏度，非常適用于復雜樣本，但夾心法通常檢測時間較長，難度大于其他方法。

　　一、雙抗夾心法實驗步驟：

　　二、雙抗夾心法實驗操作注意事項：

　　1、樣品稀釋：

　　(1)稀釋血清避免假陽性的發(fā)生(把蛋白按照一定的倍數(shù)稀釋，如10倍、20倍，將抗原進行稀釋包被反應(yīng);用稀釋好的陽性參閱血清和陰性參閱血清進行孵育后洗刷，加入酶結(jié)合物進行反應(yīng)，孵育洗滌，加入底物顯色，停止反應(yīng)后分別測定O.D值，O.D值≥1.0的抗原稀釋度為適合的包被濃度。陰性參閱血清O.D值<0.1-0.2。這樣陽性參閱血清和陰性參閱血清的O.D值就會有明顯差別)。

　　(2)粉末型樣本需要短暫離心，如沾到管蓋、管壁需要將標準品沉入管底;加入蒸餾水時需短暫輕柔渦旋，靜置10-30min，充分溶解。

　　(3)加水后等待充分溶解后可選擇吸吹或渦旋混勻。

　　2、試劑平衡：

　　(1)所有的試劑和樣本需平衡至室溫5-10min，避免產(chǎn)生動力學反應(yīng)差異這會影響準確性。

　　3、混勻：

　　(1)稀釋前、后的樣品需進行搖床充分混勻。

　　4、加樣操作：

　　(1)定期校準移液搶。

　　(2)加樣前需混勻，避免加入到孔壁上，盡可能避免氣泡產(chǎn)生。

　　(3)避免樣本濺出(可用吸水紙吸取濺出液體)。

　　(4)避免加樣槍頭反復吸取導致樣本污染。

　　(5)加樣操作按照說明書的順序來進行，確保顯色時間一致。

　　5、孵育：

　　(1)震蕩孵育，加快抗原抗體之間的相互接觸，使反應(yīng)更加充分。

　　(2)水浴溫度保持37℃。

　　(3)水浴需要封閉防止污染。

　　6、洗板：

　　(1)洗液盡量不要溢出孔外。

　　(2)拍過酶標記物后及時更換吸水紙，避免影響實驗的準確性。

　　(3)手工洗板時拍板要垂直且用力不能過猛，可避免交叉污染。

　　(4)扣干后的酶標板應(yīng)快速加液，避免干板太久。

　　(5)采用全自動時需檢查各項水瓶是否充足。

　　(6)采用全自動時檢查是否堵塞。

　　7、顯色：

　　(1)顯色需控制好時間(根據(jù)說明書操作),時間過短,結(jié)果偏低;時間過長,空白增高/非特異性顯色增加。

　　(2)顯色呈梯度。

　　8、比色：

　　(1)跟換濾光片時注意錯用的可能性。

　　9、檢測：

　　(1)酶標儀使用前預熱10-15min，結(jié)果更穩(wěn)定。

　　(2)雙波長測定吸光值，可以減少指紋、雜質(zhì)等帶來的誤差(檢測波長450nm-參考波長630nm(570nm))。

　　二、試劑盒選擇注意事項：

　　1、選擇明確：

　　(1)樣本種屬類型

　　(2)樣本類型：

　　2、樣品中檢測物水平選擇：

　　(1)寬動力學檢測范圍：對樣品種待測物水平?jīng)]有任何參考數(shù)據(jù)。

　　(2)高靈敏度試劑：待檢物含量很低。

　　3、樣品獲得性選擇：

　　(1)通常試劑盒的樣品用量在40μL或100μL，少部分用量20μL左右。

　　4、試劑盒技術(shù)參數(shù)選擇：

　　(1)回收率達到80-120%之間。

　　(2)按照國際標準示值誤差：100μg。

　　(3)誤差系數(shù)<5%-8%。

　　(4)建議優(yōu)先考慮雙單抗。

　　(5)操作方便

　　三、常見問題解答：

　　1、樣本的處理、收集和保存問題：

　　(1)細胞培養(yǎng)上清通過離心收集，分裝保存，溫度-20℃。

　　(2)血清樣本分離管分離血清，樣本凝集30min后離心，吸取血清立即檢測，分裝保存，溫度-20℃。

　　(3)血漿樣本采用EDTA收集樣本，需在30min內(nèi)離心，吸取樣本立即檢測，分裝保存，溫度-20℃。

　　(4)避免選擇嚴重溶血或高血脂樣本，收集后快速檢測并儲存，若未能在24h內(nèi)檢測，可暫時存放2-8℃。

　　(5)分析前樣本需緩慢恢復至室溫，注意是否有沉淀物需祛除干凈。

　　2、樣本反復凍融，具有哪些影響：

　　(1)蛋白易降解。

　　(2)細胞上清凍融1-2次后，蛋白降解嚴重。

　　3、陰性對照和空白對照的區(qū)別：

　　(1)空白對照：稀釋液代替樣本，檢測顯色本地，讀取陽性、陰性、樣本孔的吸光值。

　　(2)陰性對照：樣本與待檢測物具有同源、同質(zhì)性，但不含有待檢測物質(zhì)，可鑒別處理因素之間的差異性。

　　4、添加顯色后，無色或陽性對照弱：

　　(1)試劑盒需采用同批次。

　　(2)注意稀釋倍數(shù)是否正確。

　　(3)酶結(jié)合物是否未添加。

　　(4)試劑是否添加錯誤。

　　(5)顯色液是否變質(zhì)。

　　(6)確認各項容器干凈無污染。

　　(7)注意配置時看清標簽和說明書。

　　(8)觀察液面高度是否一致，避免試劑漏加。

　　5、樣本濃度不正確：

　　(1)標曲是否適合，有無失效等。

　　(2)樣本含量或靈敏度較低無法被檢測到，濃縮樣本。

　　(3)樣本含量或靈敏度較高，超過標曲濃度需稀釋樣本。

　　6、為什么吸光值過高：

　　(1)若如絕對值正確，則顯色過高。

　　(2)波長選擇錯誤，可選擇雙波長檢測。

　　7、為什么吸光值低：

　　(1)樣本未充分溶解，(混勻后需靜置30min)。

　　(2)樣本反復凍融，活性減弱。

　　(3)孵育的溫度和時間為滿足要求(按照說明書操作)。

　　8、無梯度：

　　(1)樣本污染，需要跟換樣本。

　　(2)稀釋倍數(shù)錯誤，重新做。

　　(3)抗體濃度高，更換抗體或稀釋。

　　(4)底物孵育是否時間和溫度過短。

　　(5)孵育需封蓋。

　　實驗結(jié)果匯總事項：

　　ELISA試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。古朵試劑盒

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