ELISA試劑盒中血漿和血清可同等應(yīng)用

　　古朵生物—將ELISA試劑盒的常見操作要點(diǎn)，歸納總結(jié)如下:

　　1 標(biāo)本的采取和保存

　　可用作ELISA試劑盒測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛，體液、分泌物和排泄物)等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定(如血清、尿液)，有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本。在血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的測(cè)ELISA試劑盒定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。

　　血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA試劑盒中可使本底加深。一般說來，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過一周測(cè)定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑(見3.2.4)。

　　2 ELISA試劑盒的準(zhǔn)備

　　按ELISA試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA試劑盒中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測(cè)量較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。ELISA試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。

　　Elisa試劑盒具體操作如下：

　　1、試劑準(zhǔn)備：根據(jù)選擇的試劑盒準(zhǔn)備好相關(guān)試劑。

　　2、樣品準(zhǔn)備：血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織標(biāo)本等。

　　3、試劑配置

　　4、抗體包被：Coating Buffer: 稀釋成Coating Buffer (1×)，根據(jù)產(chǎn)品說明書稀釋抗體，每孔加入100ul預(yù)稀釋的抗體，4°C過夜孵育(16-18h)。

　　5、使用前，將所有試劑充分混勻，避免產(chǎn)生泡沫。

　　6、根據(jù)實(shí)驗(yàn)孔(空白和標(biāo)準(zhǔn)品)數(shù)量，確定所需的板條數(shù)目。樣品(含標(biāo)準(zhǔn)品)和空白都應(yīng)做復(fù)孔。

　　7、加樣：100 μL/well 加入稀釋后的 Cytokine standard 至標(biāo)準(zhǔn)品孔，100 μL/well 加入樣品至樣品孔，100 μL/well 加 Dilution buffer R (1×)入空白對(duì)照孔。

　　8、加檢測(cè)抗體：根據(jù)產(chǎn)品說明書加入 Biotinylated antibody 。混勻后蓋上封板膜，室溫孵育。

　　9、洗板：扣去孔內(nèi)液體，300 μL/well 加入 1×washing buffer;停留 1 分鐘后棄去孔內(nèi)液體。重復(fù) 3 次，每一次在濾紙上扣干。

　　10、加酶：根據(jù)產(chǎn)品說明書加入稀釋好的酶，孵育。

　　11、洗板：重復(fù)步驟 5 。

　　12、顯色：100 μL/well 加入 TMB，室溫(18-25℃)避光孵育5-30分鐘之間，根據(jù)孔內(nèi)顏色的深淺(深藍(lán)色)來判定終止反應(yīng)。通常顯色 10-20 分鐘可以達(dá)到很好的效果。

　　13、終止反應(yīng)：迅速 100 μL/well 加入 Stop solution 終止反應(yīng)。

　　14、讀板：終止后 10 分鐘內(nèi)，用檢測(cè)波長(zhǎng)(measurement wavelength)450 nm 讀值。推薦用雙波長(zhǎng)即檢測(cè)波長(zhǎng)(measurement wavelength)450 nm 、參考波長(zhǎng)或校正波長(zhǎng)(reference wavelength )610-630 nm 同時(shí)讀板，測(cè)量結(jié)果會(huì)更準(zhǔn)確。

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