古朵實驗匯總：RNA操作注意事項與實驗技巧

　　操作注意事項：

　　由于rna酶的廣泛存在與難以滅活的頑固特性。使得RNA的提取純化和后續(xù)工作變得非常困難。為了保證RNA的研究工作成功，請仔細閱讀下列注意事項，相信它能幫助您解決常見的問題。

　　歸根究底，RNA工作的主要問題是防止RNA酶的污染。RNA酶無處不在，在實驗操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不當(dāng)操作都有可能造成RNA酶污染，從而導(dǎo)致整個實驗失敗。因此，嚴格控制實驗條件，避免任何可能的污染是保證實驗成功的關(guān)鍵，必須做到以下幾點：

　　1.如果可能，實驗室應(yīng)辟出專門RNA操作區(qū)，離心機、移液槍、試劑等均應(yīng)專用。RNA操作區(qū)應(yīng)保持清潔，并定期進行消毒。

　　2.操作過程中應(yīng)自始至終佩戴拋棄式橡膠或乳膠手套，并經(jīng)常更換，以避免將手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。盡量避免使用拋棄式塑料手套。塑料手套不貼身，常常造成操作不便，而且多出部分還容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染處傳遞，擴大污染。

　　3.盡量使用一次性槍頭、離心管等塑料制品，盡量避免與其它實驗共享器具，以防止交叉污染。推薦使用出廠前已經(jīng)滅菌的槍頭和離心管，大多國外廠商供應(yīng)的無菌塑料制品很少有RNA酶污染，買來后可直接用于RNA操作。許多研究者用DEPC等處理的塑料制品，往往由于二次污染而帶有RNA酶，從而導(dǎo)致實驗失敗。

　　4.配制溶液用的酒精，異丙醇、Tris等應(yīng)采用未開封的新品。溶液需用DEPC水配制(加0.01%(體積比)DEPC至重蒸水或Mili Q級水中，處理過夜，滅菌即成DEPC水)。

　　5.所有玻璃制品都必須在240℃烘烤4小時。所有舊塑料制品都必須用0.5M的NaOH處理10分鐘，并用DEPC-H2O沖洗后滅菌，也可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。無法用DEPC處理的用具可以用氯仿擦拭若干次，這樣通常可以消除RNA酶的活性。

　　樣本保存的注意事項：

　　樣本一旦從生物體中分離后，細胞內(nèi)的RNA就變得非常不穩(wěn)定，容易降解。因此取樣后，如何保證取樣前后基因的表達模式不變，就變得非常重要。傳統(tǒng)方法是用液氮速凍，再放到超低溫冰箱中保存。

　　目前有些廠家開發(fā)出專門的RNA保護劑，如Qiagen公司的RNAlater是具有抑制RNase和穩(wěn)定RNA作用的試劑，將采集的組織樣本等直接放入到RNAlater中，即可起到穩(wěn)定樣本中RNA的作用。無需液氮或干冰，方便安全地在室溫下保存一段時間，低溫可長期保存。還有對細菌樣本專用的RNAprotect Bacteria Reagent及對血液樣本專用的PAXgene™ Blood RNA System。

　　RNA的定量與純度：

　　RNA通常用分光光度計定量，測量在260 nm處的吸收值(A260)。通常分光光度計A260的讀數(shù)要介于0.15-1.0之間才是可靠的，因此RNA提取結(jié)束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋(推薦用10 mM Tris.HCl, pH 7.0稀釋)到適當(dāng)濃度范圍，再用分光光度計測量。A260為1相當(dāng)于RNA的濃度為40 µg/ml。

　　為了檢測RNA的純度，可以測量A260與A280的比值，通常純RNA的A260/A280為1.9-2.1。

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