古朵闡述：PCR常見問題及回答

　　一、RT-PCR1. cDNA產(chǎn)量的很低可能的原因：

　　>RNA模板質(zhì)量低

　　>對mRNA濃度估計過高

　　>反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足

　　>同位素磷32過期

　　>反應體積過大，不應超過50μl2. 擴增產(chǎn)物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺*最常見的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系

　　>與反應起始時RNA的總量及純度有關

　　>>建議在試驗中加入對照RNA

　　>第一鏈的反應產(chǎn)物在進行pcr擴增時，在總的反應體系中的含量不要超過1/10

　　>建議用oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物(GSP)用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級結構，如環(huán)狀結果，有可能導致GSP無法與模板退火;或SSⅡ反轉錄酶無法從此引物進行有效延伸。

　　>目的mRNA中含有強的轉錄中止位點，可以試用以下方法解決：

　　a. 將第一鏈的反應溫度提高至50℃。

　　b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進行第一鏈反應。3. 產(chǎn)生非特異性條帶*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

　　>在PCR反應中，非特異的起始擴增將導致產(chǎn)生非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產(chǎn)生。

　　>由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導致產(chǎn)生不同的RT-PCR結果。4. 產(chǎn)生彌散(smear)條帶*在PCR反應體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過高

　　>減少引物的用量

　　>優(yōu)化PCR反應條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)

　　>在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會產(chǎn)生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶*大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的

　　>對于長片段的PCR，建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)6. 在無反轉錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結果*通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導致的。由于進行體外轉錄時不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。

　　>有可能是引物二聚體的條帶7. 擴增產(chǎn)物滯留在加樣孔中*有可能是由于模板量過高而導致PCR結果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將第一鏈結果至少稀釋100倍再進行二次擴增。

　　>另外，在二次PCR時使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。8. SSⅢ與SSⅡ有何不同?*具有更高的熱穩(wěn)定性(達50℃)

　　>具有更長的半衰期(達220分鐘)

　　>對PCR無抑制

　　>干冰運輸

　　>Tdt活性更低9. 為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript?ThermoScript如果保存不當會引起活性很快降低，SSⅢ則更穩(wěn)定。10. 為什么使用基因特異性引物(GSP)?GSP在擴增低豐度的轉錄本時是。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長轉錄本的逆轉錄;隨機引物用于mRNA片段的逆轉錄。11. 什么情況下需要使用RNase H?在第一輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時12. 根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：

　　目的建議RT與PCR使用不同的引物

　　或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶兩步法RT-PCR系統(tǒng)高靈敏度一步法或兩步法RT-PCR系統(tǒng)高特異性含有適當?shù)腄NA聚合酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)

　　或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)高保真度含有Pfx Taq酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)長的反轉錄結果通常使用兩步法RT-PCR系統(tǒng)可達到最佳結果

　　含Elongase酶的一步法RT-PCR系統(tǒng) 二、Generacer1. 如何針對Generacer試劑盒設計基因特異性引物(GSP)?使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設計引物時需要注意以下幾點要求：

　　>50-70%的GC含量，以提高引物熔點(Tm)

　　>23-28個堿基長度，以提高引物特異性

　　>降低3’端GC含量，將引物非特異性結合的可能性降至2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物?*加入Hela對照

　　>低質(zhì)量的RNA模板

　　>逆轉錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長模板cDNA的合成

　　>目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環(huán)次數(shù)來解決，建議使用巢式PCR

　　>目的基因沒有表達，可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因

　　>目的基因太長而不適合進行反轉錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來得到全長cDNA，使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進行PCR。

　　>cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優(yōu)化PCR反應參數(shù)及反應體系;降低退火溫度;使用5-10%的DMSO幫助通過高GC含量區(qū);使用高保真度和高延伸能力的酶進行PCR反應。3. RACE的PCR結果有雜帶RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：

　　>GSP與其他cDNA的非特異性結合會導致在擴增目的產(chǎn)物時得到無關產(chǎn)物。

　　>GeneRacer引物和cDNA的非特異性結合會導致產(chǎn)生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產(chǎn)物。

　　>RNA降解。

　　>PCR管或試劑污染。

　　注意：雜帶一般是因為沒有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對照來確定。4. 得不到全長的5’RACE PCR產(chǎn)物*CIP反應后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無降解。

　　>CIP脫磷酸不，可以增加反應中CIP的量或減少RNA的量。

　　>PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。

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