古朵技術(shù)—姐妹染色單體差別染色

　　姐妹染色單體區(qū)分染色法 (Sister chromatid differentiation ， SCD )是 70 年代中期發(fā)展起來的染色體處理技術(shù)。 Latt ( 1973 )在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入 5- 溴脫氧核苷( BrdU )，當(dāng)用 Hoechst33258 熒光染料染色時，發(fā)現(xiàn)了姊妹染色單體的色差反映和它們之間互換的現(xiàn)象。

　　1974 年 KO Renberg 和 Froeed-Lender 改進(jìn)了這一技術(shù)，建立了較簡易的 BrdU-Giemsa 技術(shù)。這種技術(shù)用于研究細(xì)胞周期、染色體半保留復(fù)制、染色體的分子結(jié)構(gòu)和畸變，以及 DNA 的復(fù)制、損傷與修復(fù)等一系列重要理論問題，還可以用于分析姊妹染色單體互換( Sister chromatid exchange, SCE )頻率。

　　由于 SCE 能靈敏地檢測染色體的變化，表現(xiàn)出劑量 - 效應(yīng)關(guān)系。因此，目前已把 SCE 列為檢測致突變物、致癌物地常規(guī)指標(biāo)之一。

　　一、原理

　　5- 溴脫氧核苷( 5-Bromodeoxy-urdine, BrdU )在 DNA 的復(fù)制過程中，摻入新合成的鏈并占有胸腺嘧啶( thymidine, T )的位置。根據(jù) DNA 的半保留復(fù)制規(guī)律，哺乳動物或人的細(xì)胞在 BrdU 的培養(yǎng)液中經(jīng)歷了兩個周期后，它的兩條姊妹染色單體的 DNA 雙鏈在化學(xué)組成上有了差別。

　　當(dāng)染色體的 DNA 鏈的兩條多核苷酸鏈都被 BrdU 所替換， Giemsa 染色顯示淺色，如果染色體的 DNA 鏈中僅有一條多核苷酸鏈被 BrdU 所替換， Giemsa 染色顯示深色。應(yīng)用姊妹染色單體區(qū)分染色法( SCD )研究來自一個染色體的兩條單體之間在同一個位點發(fā)生同源片段的交換，稱為姊妹染色單體互換。

　　二、用品和試劑

　　45 ℃水浴，紫外線燈( 20W )。余同外周血染色體制備。

　　試劑： BrdU 溶液：用無菌瓶，在普通條件下稱取 BrdU 2mg ，然后在無菌室內(nèi)加入無菌生理鹽水 4ml ，用黑紙避光， 4 ℃冰箱保存，新鮮配置。 1 × SSC 溶液： 0.15mol/L NaCl ， 0.015mol/L 檸檬酸鈉。

　　三、操作步驟

　　l .細(xì)胞培養(yǎng)：常規(guī)培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞， 24h 后，加入 BrdU 使其終濃度為 20 μ g/ml 。

　　2 .繼續(xù)避光培養(yǎng) 48 小時，終止培養(yǎng)前 2 — 3 小時加。

　　3 .培養(yǎng)結(jié)束收獲細(xì)胞，常規(guī)制備染色體，操作同實驗一。

　　4 .染色體制片在 37 ℃恒溫箱內(nèi)老化 24 小時或室溫放置 1 — 2 天。

　　5 .將染色體制片的玻片正面向上平鋪在恒溫( 45 ℃)水浴鍋上，在玻片上滴加已預(yù)熱至 45 ℃的 1 × SSC 溶液。

　　6 .將紫外燈放在恒溫水浴上，燈與標(biāo)本垂直，其外加蓋報紙數(shù)張以阻擋紫外線。照射距離為 6cm ，時間 15min 。

　　7 .照射完畢后以蒸餾水洗去 1 × SSC 。

　　8 . 1 ∶ 10 Giemsa 染色 5 分鐘。

　　9 .自來水細(xì)流沖洗去多余染料，干燥，鏡檢。

　　10 .計數(shù) SCE 。選擇染色體分散較好，數(shù)目為 46 的中期分裂相 20 個進(jìn)行觀察計數(shù)，凡在染色單體端部出現(xiàn)的互換計為一次 SCE ，在染色單體中間出現(xiàn)的互換計為兩次 SCE 。凡在著絲粒部位發(fā)生一次互換，判斷不是兩條染色單體在著絲粒部發(fā)生的扭轉(zhuǎn)，計為一次 SCE ，但另列入“著絲粒區(qū)互換( CME )"一項。

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