蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)方法@古朵技術(shù)資料

　　免疫共沉淀和親和層析共分離：

　　免疫共沉淀是證明蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的最直接經(jīng)典和有效的方法，如蛋白A能與B相互作用結(jié)合成異源二聚體，無論用抗A或抗B的抗體或與A或B的親和物偶聯(lián)的agarose小珠都能把A和B沉淀下來。因此廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用研究。

　　常用的小珠：

　　GST-Agarose(不需要抗體)

　　ProteinA-Agarose(用時(shí)需加抗體)

　　基本方法：

　　1.表達(dá)蛋白質(zhì)A

　　2.蛋白質(zhì)A與親和小珠結(jié)合

　　3.用結(jié)合有蛋白質(zhì)A的親和小珠調(diào)取細(xì)胞破碎液中蛋白質(zhì)B

　　4.離心、洗滌親和小珠若干次

　　5.處理親和小珠使蛋白質(zhì)A、B解吸附(可以直接用SDS-PAGE上樣BUFFER煮)

　　酵母雙雜交系統(tǒng)

　　基本原理，以酵母S.cerevisiae的轉(zhuǎn)錄因子GAL4系統(tǒng)為例

　　GAL4有兩個(gè)結(jié)構(gòu)上互相分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。

　　N 端1-147aa與DNA結(jié)合(DNA binding domain,BD)。

　　C端768-881aa能激活轉(zhuǎn)錄(Activation Domain,AD)。

　　BD+AD—能激活GAL4效應(yīng)基因的上游激活序列(UAS)。

　　把N和C分開分別構(gòu)建成兩種表達(dá)質(zhì)粒。如把Gal4的N端和誘餌蛋白(研究的目標(biāo)蛋白A)融合表達(dá)，把細(xì)胞cDNA和C端融合表達(dá)，cDNA編碼的蛋白x如能和A互相作用,就能把Gal4N端C端和N端聯(lián)系在一起，就可以激活UAS下游的基因表達(dá)。

　　半乳糖苷酶(Laz)基因克隆到URA3的下游。

　　在x-Gal的存在下酵母菌落成藍(lán)色(Fields)

　　酵母GAL4基因缺失;GAL80基因缺失(GAL4的負(fù)調(diào)控因子)

　　方法略

　　假陽性多，因此還必須再用免疫共沉淀等直接證據(jù)證明

　　發(fā)展：哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)、二倍體雙雜交系統(tǒng)、酵母單雜交系統(tǒng)、細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)、酵母三雜交系統(tǒng)

　　FAR WESTERN

　　Western blot 是免疫印記，而Far western 是蛋白質(zhì)鋪蓋技術(shù)，兩者其實(shí)在本質(zhì)上是相似的，只是免疫印記是直接用抗體去檢測抗原，常用于蛋白質(zhì)定性;而Far western則是用標(biāo)記的蛋白(125I或熒光)去probe與之相互作用的蛋白，或再用抗這種蛋白的抗體顯示這種蛋白的結(jié)合位置，用于研究蛋白質(zhì)的相互作用。

　　基本步驟：

　　1.表達(dá)和提純獲得蛋白A，并作熒光或放射性標(biāo)記，或制備抗A抗體

　　2.細(xì)胞總蛋白SDS-PAGE(一起染色，另一塊轉(zhuǎn)膜)

　　3.電轉(zhuǎn)膜

　　4.封閉

　　5.加入蛋白A，如A帶標(biāo)記，洗膜后直接顯影;如未標(biāo)記，可加抗A抗體再加二抗或標(biāo)記的蛋白A。

　　優(yōu)點(diǎn)：簡單、經(jīng)濟(jì)

　　缺點(diǎn)：SDS-PAGE影響蛋白質(zhì)構(gòu)象，可能影響相互作用

　　蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)方法 上海古朵生物科技有限公司，由具有資深行業(yè)背景和豐富市場經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人士組成，致力于為生命科學(xué)研究領(lǐng)域提供產(chǎn)品，為廣大科研工作者提供服務(wù)。既能滿足研發(fā)類客戶對產(chǎn)品種類、包裝、純度的特殊要求，也能滿足生產(chǎn)型企業(yè)從小試、中試到規(guī)?；a(chǎn)各個(gè)階段的綜合需求。產(chǎn)品涵蓋有機(jī)試劑、無機(jī)試劑和生化試劑，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、天然植物提取物及中藥標(biāo)準(zhǔn)品，核酸、酶、緩沖劑、顯色底物，醫(yī)藥中間體、原料藥、催化劑、高純?nèi)軇?、特種高分子材料及實(shí)驗(yàn)室常用耗材。品種類超過2萬種，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞藥理、藥劑、分子生物學(xué)等科研領(lǐng)域。