慢病毒包裝簡(jiǎn)要步驟
以六孔板中的1孔為例，每個(gè)樣品需要1×106個(gè)293T細(xì)胞。
1. 取1.5 ml滅菌EP管，加入1.5 μg包裝混合質(zhì)粒和0.5 μg表達(dá)質(zhì)粒以及250 μl的無(wú)血清培養(yǎng)基。輕柔混勻，室溫孵育5 min。
2. 取1.5 ml滅菌EP管，取9 μl 脂質(zhì)體2000 l溶于250 μl無(wú)血清培養(yǎng)基中。輕柔混勻，室溫孵育5 min。
3. 將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液輕柔混勻。室溫孵育20 min
4. 用胰酶消化并記數(shù)293T細(xì)胞。用含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
5. 在六孔板中每孔，加入1 ml含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，再加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。
6. 將1 ml重懸的293T細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞/ml)加入到平板中。37 ℃ CO2孵箱中孵育過(guò)夜。
7. 移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基移除，代之以DMEM(含丙酮酸鈉和非必須氨基酸)。
7. 轉(zhuǎn)染后48-72 h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20 min，去除沉淀。
8. 病毒上清-80 ℃貯存。
包裝出來(lái)的慢病毒對(duì)NIH/3T3細(xì)胞達(dá)90%以上感染效率。
注意事項(xiàng)
1. 在慢病毒感染細(xì)胞前，為檢測(cè)病毒上清培養(yǎng)液內(nèi)病毒的活性，并確定病毒與轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間的比率，需要確定病毒的滴度。病毒的滴度可以通過(guò)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，然后使用抗體篩選穩(wěn)定的細(xì)胞轉(zhuǎn)染株，進(jìn)行計(jì)數(shù)和數(shù)值統(tǒng)計(jì)。
2. 在慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的過(guò)程中最重要的一步是融合，只有一些較小的慢病毒載體才能轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞，因此，病毒顆粒的吸附是慢病毒轉(zhuǎn)染的限速步驟。
