這種紅色熒光鬼筆環(huán)肽偶聯(lián)物（相當(dāng)于 Alexa Fluor® 594 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽）選擇性地結(jié)合 F-肌動(dòng)蛋白。以納摩爾濃度使用，鬼筆環(huán)肽衍生物是用于標(biāo)記、鑒定和定量甲醛固定和透化組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)或無細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的 F-肌動(dòng)蛋白的便捷探針。鬼筆環(huán)肽與肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)合比與肌動(dòng)蛋白單體更緊密地結(jié)合，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白亞基從絲端解離的速率常數(shù)降低，基本上通過防止絲解聚來穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白絲。此外，發(fā)現(xiàn)鬼筆環(huán)肽可抑制 F-肌動(dòng)蛋白的 ATP 水解活性。鬼筆環(huán)肽在細(xì)胞中的不同濃度下功能不同。當(dāng)以低濃度引入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，鬼筆環(huán)肽將細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白的聚合程度較低的形式以及細(xì)絲蛋白募集到聚集的肌動(dòng)蛋白聚合物的穩(wěn)定“島"中，但它不會(huì)干擾應(yīng)力纖維，即微絲的粗束。

鬼筆環(huán)肽的特性是研究 F-肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞中分布的有用工具，方法是用熒光類似物標(biāo)記鬼筆環(huán)肽并使用它們對(duì)肌動(dòng)蛋白絲進(jìn)行染色以進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查。鬼筆環(huán)肽的熒光衍生物已被證明在定位活細(xì)胞或固定細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白絲以及在體外觀察單個(gè)肌動(dòng)蛋白絲方面非常有用。熒光鬼筆環(huán)肽衍生物已被用作高分辨率肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)研究的重要工具。

準(zhǔn)備工作解決方案：

艾美捷鬼筆環(huán)肽-iFluor 594偶聯(lián)物工作溶液

將 1 µL 艾美捷鬼筆環(huán)肽-iFluor 594 偶聯(lián)溶液加入 1 mL 含 1% BSA 的 PBS。

注意：鬼筆環(huán)肽結(jié)合物的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分裝并儲(chǔ)存在-20°C。避光。

注意：不同的細(xì)胞類型可能會(huì)有不同的染色。應(yīng)相應(yīng)地制備鬼筆環(huán)肽結(jié)合物工作溶液的濃度。

艾美捷鬼筆環(huán)肽-iFluor 594偶聯(lián)物示例實(shí)驗(yàn)：

染色細(xì)胞

1.進(jìn)行甲醛固定。將細(xì)胞與 PBS 中的 3.0–4.0% 甲醛在室溫下孵育 10–30 分鐘。

注意：避免使用任何含有甲醇的固定劑，因?yàn)榧状紩?huì)在固定過程中破壞肌動(dòng)蛋白。優(yōu)選的固定劑是不含甲醇的甲醛。

2.在 PBS 中沖洗固定細(xì)胞 2-3 次。

3.可選：將 PBS 中的 0.1% Triton X-100 添加到固定細(xì)胞中 3 到 5 分鐘以增加滲透性。在 PBS 中沖洗細(xì)胞 2-3 次。

4.將 100 μL/孔（96 孔板）的 Phalloidin-iFluor™ 594 Conjugate 工作溶液加入固定的細(xì)胞中，并在室溫下染色細(xì)胞 20 至 90 分鐘。

5.用 PBS 輕輕沖洗細(xì)胞 2 到 3 次以去除多余的鬼筆環(huán)肽結(jié)合物，然后用 TRITC 或德州紅濾光片組在顯微鏡下進(jìn)行電鍍、密封和成像。

圖：用 4% 甲醛固定的 HeLa 細(xì)胞的熒光圖像，然后用 Cell Navigator™ F-Actin Labeling Kit *Red Fluorescence* 在 Costar 黑色 96 孔板中染色。細(xì)胞分別用 艾美捷鬼筆環(huán)肽-iFluor 594（Cat#23122，紅色）和細(xì)胞核染料 DAPI（Cat#17507，藍(lán)色）標(biāo)記。細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 在固定前用 ER Green™（Cat#22635，綠色）染色。