艾美捷FAM-FLICA Caspase-1 (YVAD) Assay Kit FAM-FLICA Caspase-1 活性分析試劑盒檢測(cè)方案：

1、凋亡誘導(dǎo)：

在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，確定可重復(fù)的方法用于通過(guò)觸發(fā)胱天蛋白酶活性獲得陽(yáng)性對(duì)照。此過(guò)程隨每個(gè)細(xì)胞系而顯著變化。例如，細(xì)胞凋亡可能是用2-4µg/mL喜-樹(shù)堿或1-2µM星形孢霉素誘導(dǎo)>4小時(shí)。  

2、焦下垂誘導(dǎo)：

最佳的焦下垂/胱天蛋白酶-1誘導(dǎo)方案將有顯著差異在細(xì)胞系之間。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，確定獲得caspase-1陽(yáng)性對(duì)照的可重復(fù)方法。例如在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用5-10ng/mL肉豆蔻酸佛波酯（PMA）12-24小時(shí)（直到細(xì)胞粘附），然后暴露于100 ng/mL脂多糖（LPS）和5mM三磷酸腺苷（ATP）混合24小時(shí)?；蛘?，在37°C下，在1-20µM的細(xì)胞培養(yǎng)基中使用尼格瑞金，可在細(xì)胞中誘導(dǎo)2-24小時(shí)。每個(gè)研究者應(yīng)調(diào)整Nigericin的濃度和治療期，以適應(yīng)特定的細(xì)胞系和研究條件。

3、FLICA的制備：

FLICA以凍干粉形式提供小瓶?jī)?nèi)的虹彩光澤。避免光線照射，并在以下情況下使用手套處理。因?yàn)楸仨毩⒓词褂?span style="font-family: Calibri;">30X FLICA溶液，所以在染色前準(zhǔn)備好。1.用50µL DMSO重新配制每小瓶FLICA，形成150X股-票儲(chǔ)備溶液應(yīng)為無(wú)色至黃色或橙色。一旦復(fù)原，可將其儲(chǔ)存在≤-20°C，保護(hù)6個(gè)月在此期間解凍不超過(guò)兩次。2.在加入樣品和對(duì)照品之前，立即稀釋通過(guò)向每個(gè)小瓶中添加200µL PBS，形成30X FLICA 1:5解決方案在稀釋到水溶液中30分鐘內(nèi)使用30X FLICA

緩沖區(qū)。

4、1X凋亡洗滌緩沖液的制備：

ICT的細(xì)胞凋亡洗滌緩沖液（目錄#634和#635，AWB）是一種等滲溶液，用于在暴露于FLICA后洗滌細(xì)胞。它含有哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，可穩(wěn)定用FLICA染色的細(xì)胞和疊丨氮化鈉細(xì)菌生長(zhǎng)（1X凋亡洗滌緩沖液含有0.01%w/v鈉疊丨氮化物）?？梢允褂煤?span style="font-family: Calibri;">FBS和其他添加劑的細(xì)胞培養(yǎng)基以洗滌細(xì)胞而不是細(xì)胞凋亡洗滌緩沖液。

10X細(xì)胞凋亡洗滌緩沖液在冷藏期間可能形成沉淀。如果發(fā)生這種情況，輕輕加熱，直到所有晶體溶解。不要煮沸。

在diH2O中以1:10稀釋10X凋亡洗滌緩沖液。例如，添加15mL 10X細(xì)胞凋亡洗滌緩沖液至135mL diH2O，總共150mL。

•1X凋亡洗滌緩沖液可儲(chǔ)存在2-8°C，或冷凍并在6個(gè)月內(nèi)使用。

圖：Jurkat細(xì)胞用陰性對(duì)照DMSO（左）或凋亡誘導(dǎo)劑星孢霉素（右）處理4小時(shí)，然后用ICT染色綠色聚半胱天冬酶抑制劑探針FAM-VAD-FMK（試劑盒#92）1小時(shí)。細(xì)胞洗滌兩次并在流式細(xì)胞儀上讀取。陰性對(duì)照僅在3.3%的細(xì)胞群中表現(xiàn)出半胱天冬酶活性（P3，左側(cè)直方圖），而星孢霉素治療誘導(dǎo)的caspase活性為94.8%（P3，右直方圖）。這是28:1的比率。數(shù)據(jù)特蕾西·墨菲女士提供，ICT，10G5。

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒組分：

The test size kit contains:

• 1 bottle of FAM-FLICA cystatin reagent

• 1 bottle of 10X apoptosis washing buffer (15 mL), # 635

• 1 bottle of fixative (6 mL), # 636

• 1 vial of iodopropyl, 250 µ g/mL (1 mL), # 638

• 1 vial Hoechst 33342200 µ g/mL (1 mL), # 639

The standard size kit contains:

• 4 bottles of FAM-FLICA cystatin reagent

• 1 bottle of 10X apoptosis washing buffer (60 mL), # 634

• 1 bottle of fixative (6 mL), # 636

• 1 vial of iodopropyl, 250 µ g/mL (1 mL), # 638

• 1 vial Hoechst 33342200 µ g/mL (1 mL), # 639.

將未開(kāi)封的套件和每個(gè)未開(kāi)封的組件儲(chǔ)存在2-8°C，直到到期日期。一旦用DMSO重新配制，立即使用FLICA，或在≤-20°C的溫度下儲(chǔ)存6個(gè)月，避光，解凍時(shí)間不超過(guò)在這段時(shí)間內(nèi)兩次。

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:

用FLICA染色細(xì)胞可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。然而FLICA用于活細(xì)胞，需要定期維護(hù)和提前幾天栽培。此外，一旦正確的數(shù)字已經(jīng)培養(yǎng)了個(gè)細(xì)胞，必須為實(shí)驗(yàn)分配時(shí)間治療或半胱天冬酶激活過(guò)程。創(chuàng)建細(xì)胞群，例如：

a、 暴露于實(shí)驗(yàn)處理的細(xì)胞

b、 接受安慰劑的陰性對(duì)照細(xì)胞群治療

當(dāng)FLICA檢測(cè)到催化活性形式的胱天蛋白酶時(shí)酶，計(jì)劃實(shí)驗(yàn)，以使FLICA在細(xì)胞中預(yù)期胱天蛋白酶被激活時(shí)被稀釋和給藥。30X FLICA的推薦體積為每300µL細(xì)胞10µL3-5 x 105細(xì)胞/mL，但數(shù)量可能因?qū)嶒?yàn)而異條件和用于分析的儀器。每位研究者應(yīng)調(diào)整FLICA的量以適應(yīng)特定細(xì)胞系研究條件。

將細(xì)胞培養(yǎng)至適合特定實(shí)驗(yàn)條件的最佳密度或凋亡誘導(dǎo)方案。細(xì)胞密度不應(yīng)超過(guò)106細(xì)胞/

超過(guò)此濃度培養(yǎng)的細(xì)胞可開(kāi)始自然生長(zhǎng)進(jìn)入凋亡?？赡苄枰M(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)來(lái)確定何時(shí)以及使用多少FLICA作為產(chǎn)生的正信號(hào)是培養(yǎng)過(guò)程中caspase活性的直接測(cè)量時(shí)期.