活性氧（ROS）參與許多退行性神經(jīng)系統(tǒng)病癥，如阿茲海默癥、帕金森癥性脊髓側(cè)索硬化以及年老或外傷導(dǎo)致的腦功能紊亂等。此外活性氧是植物體內(nèi)正常代謝的信號小分子，在植物的生長發(fā)育和抗逆反應(yīng)中具有重要作用。目前各領(lǐng)域中常見的四種ROS的檢測分析方法有：化學(xué)發(fā)發(fā)光法、熒光探針法、分光光度法、電子順磁共振法。

CheKine™ 活性氧（ROS）檢測試劑盒（KTB1910）提供了一種簡單、靈敏、快速的ROS檢測方法，其原理是利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測。DCFH-DA（二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯）可自由透過活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解，形成DCFH，DCFH無熒光且不能通透細(xì)胞膜，其可以被細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）氧化生成有熒光的DCF，使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測和觀察活細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光信號強(qiáng)度，即可以分析細(xì)胞活性氧的水平。

CheKine™ 活性氧（ROS）檢測試劑盒的操作步驟如下：

對于刺激時間較短（通常為2 h以內(nèi)）的細(xì)胞，建議先裝載探針，后用活性氧陽性對照或感興趣的藥物刺激細(xì)胞；對于需要較長時間刺激（通常為6 h以上）的細(xì)胞，建議先用活性氧陽性對照或感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。

1.原位裝載探針 (僅適用于貼壁細(xì)胞)

2.收集細(xì)胞后裝載探針 (適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞)

3.熒光顯微拍照

4.流式細(xì)胞分析操作方法

注意事項(xiàng)：

1.陽性對照H2O2一般使用濃度為100 μM （推濃度50-200 μM，具體依細(xì)胞類型而定） 。通常刺激后30 min-4 h可以觀察到顯著的活性氧水平升高。對于不同的細(xì)胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30 min內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可延長誘導(dǎo)時間或適當(dāng)提高活性氧陽性對照的濃度。如果熒光信號過強(qiáng)，可縮短誘導(dǎo)時間或適當(dāng)降低活性氧陽性對照的濃度。

2.實(shí)驗(yàn)過程中，如果陰性對照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1:2000-1:5000 稀釋熒光探針DCFH-DA，使DCFH-DA的終濃度為 2-5 μM。探針裝載的時間可在15-60 min 內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整，盡量縮短讀片時的曝光時間，并且試驗(yàn)組、對照組曝光時間需保持一致。

活性氧陽性對照 (H2O2) 僅僅用于作為陽性對照的樣品，并非所有試驗(yàn)組樣品中都需加入活性氧陽性對照。

3.探針裝載后，一定要洗凈未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。

4.盡量縮短探針裝載后到檢測所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

文章來源：Abbkine