細(xì)胞：CMT-167細(xì)胞

中文名稱：小鼠肺癌細(xì)胞

生長特性：貼壁

培養(yǎng)基：DMEM-H +10%FBS（GIBCO胎牛血清）

凍存條件：50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、40% FBS、10% DMSO

收到細(xì)胞后請盡快更換配套培養(yǎng)基，或自己配置的新鮮培養(yǎng)基（含15%血清），如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶培養(yǎng)基，請在原瓶培養(yǎng)基中額外添加10%的血清（原瓶培養(yǎng)基的繼續(xù)使用時間最長不宜超過72小時）。

CMT-167細(xì)胞傳代：

1）：細(xì)胞密度約80%時，吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤洗細(xì)胞兩次，加2~3 ml 0.25% yi酶進行消化細(xì)胞（注意根據(jù)實際情況，把握消化時間）。

2）：鏡下觀察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動時；

（可用吸管吸起些許yi酶輕輕吹打細(xì)胞層某處，即可肉眼可見細(xì)胞層脫落，或吹打后鏡下觀察吹打處，即消化完成，否則繼續(xù)消化）

直接吸掉yi酶，加3~4ml 培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，把細(xì)胞層吹落，吹散。

3）：取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4）：注意培養(yǎng)基PH值變化情況，定期換液（每周2-3次），待細(xì)胞密度達到80%以后重復(fù)1項操作或者凍存。

（網(wǎng)絡(luò)信息主針對網(wǎng)絡(luò)推廣作用，僅供參考，細(xì)胞培養(yǎng)請咨詢細(xì)胞庫管理員，以細(xì)胞庫管理員提供給您的信息為準(zhǔn)，操作前，如果有不明白之處，先咨詢細(xì)胞庫管理員，避免不必要的損失；）

犬瘟熱病毒(CDV)核酸檢測 逆轉(zhuǎn)錄：

根據(jù)標(biāo)本數(shù)取200μl DEPC水處理的PCR反應(yīng)管，取出CDV RT MIX室溫溶解充分混勻，向反應(yīng)管中每管加入7μl  CDV RT MIX，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶系(使用前請10,000rpm瞬時離心30s)， 以及2μl 上述獲得的RNA。

1,0000rpm瞬時離心30秒，將各反應(yīng)管放入PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，在PCR儀上進行以下循環(huán)：30℃ 5分鐘，42℃30分鐘后98℃5分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

犬瘟熱病毒(CDV)核酸檢測 PCR擴增：

取出CDV–PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10,000rpm離心10s。設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1管陰性對照+4管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系配制如下表：

（CDV–PCR MIX  24μl）（Taq酶系 2μl）  

計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10,000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入26μl，向每管中加入處理后樣品(所獲得的DNA樣品)或CDV陽性質(zhì)控品(107Copies/ml) (使用前用陰性質(zhì)控品梯度稀釋10倍、100倍、1000倍，記為1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml)和陰性質(zhì)控品4μl，10,000rpm瞬時離心30秒。

將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性控品，陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品以及未知標(biāo)本，并設(shè)置反應(yīng)體積(30μl)、樣品名稱、標(biāo)記熒光基團種類(報告基團為FAM，淬滅基團為TAMRA)和循環(huán)條件:

ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI PRISM 7000 (需要剪掉反應(yīng)蓋)，ABI PRISM7300/7500(使用8聯(lián)管)，MJ Opticon(使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器，循環(huán)條件：94℃→2分鐘，后93℃ 30秒→55℃ 45秒，40個循環(huán)。

LightCycler等使用毛細(xì)管的儀器，循環(huán)條件：94℃→2分鐘，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40個循環(huán)。