細(xì)胞：HBdSMC細(xì)胞

中文名稱：人膀胱平滑肌細(xì)胞

生長特性：貼壁

培養(yǎng)基：SMCM

凍存條件：50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、40% FBS、10% DMSO

HBdSMC細(xì)胞傳代：

1）：細(xì)胞密度約80%時(shí)，吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤洗細(xì)胞兩次，加2~3 ml 0.25% yi酶進(jìn)行消化細(xì)胞（注意根據(jù)實(shí)際情況，把握消化時(shí)間）。

2）：鏡下觀察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動(dòng)時(shí)（可用吸管吸起些許yi酶輕輕吹打細(xì)胞層某處，即可肉眼可見細(xì)胞層脫落，或吹打后鏡下觀察吹打處，即消化完成，否則繼續(xù)消化）直接吸掉yi酶，加3~4ml 培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，把細(xì)胞層吹落，吹散。

3）：取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4）：注意培養(yǎng)基PH值變化情況，定期換液（每周2-3次），待細(xì)胞密度達(dá)到80%以后重復(fù)1項(xiàng)操作或者凍存。

（網(wǎng)絡(luò)信息主針對(duì)網(wǎng)絡(luò)推廣作用，僅供參考，細(xì)胞培養(yǎng)請(qǐng)咨詢細(xì)胞庫管理員，以細(xì)胞庫管理員提供給您的信息為準(zhǔn)，操作前，如果有不明白之處，先咨詢細(xì)胞庫管理員，避免不必要的損失；）

基因分型(AIV)核酸檢測

逆轉(zhuǎn)錄  根據(jù)標(biāo)本數(shù)取0.2ml DEPC 處理的PCR反應(yīng)管，取出AIV -RT MIX室溫溶解，向反應(yīng)管中每管加入7μl AIV-RT MIX，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶系(使用前請(qǐng)10,000rpm瞬時(shí)離心30s)， 以及2μl 上述獲得的RNA，10,000rpm瞬時(shí)離心30秒，將各反應(yīng)管放入PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，在PCR儀上進(jìn)行以下循環(huán)：42℃ 30分鐘后98℃5分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

3．PCR擴(kuò)增

12345678

AIV-UAIV-H5AIV-H7AIV-H9AIV-UAIV-H5AIV-H7AIV-H9

備注：每排管蓋標(biāo)記處為1，每排共8管可檢測2個(gè)樣品，每盒5排共可檢測10個(gè)樣品。

取出AIV-反應(yīng)管，加入處理后樣品(或陰性質(zhì)控品、AIV陽性質(zhì)控品)3μl，10,000rpm瞬時(shí)離心30s。做好標(biāo)記，置PCR反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置反應(yīng)體積(30μl)、按照下列條件擴(kuò)增，94℃ 2min，93℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 30s ，共35個(gè)循環(huán)。

4．電泳檢測

4.1 2%瓊脂糖凝膠配制：稀釋50×TAE（或5×TBE）至1×TAE(取20ml50×TAE，加980 ml雙蒸水至1L)，稱4g瓊脂糖放于500mL 錐形瓶中，1×TAE 200 ml,置入微波爐中加熱熔解(避免加熱沸騰溶液外溢)，再加入20μl 溴化乙錠(EB)充分混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后使用。

4.2 電泳檢測：直接取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物15μl，用加樣槍點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm 電壓，1×TAE中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。