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過氧化物酶標(biāo)記測(cè)定法
原理:脫氧核糖核苷酸衍生物地高[(digoxigenin)-11-dUTP]在TdT酶的作用下,可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端,與dATP形成異多聚體,并可與連接了報(bào)告酶(過氧化物酶或堿性磷酸酶)的抗地高抗體結(jié)合。在適合底物存在下,過氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng),特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞,因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。
毛地黃植物是地高的*來源。在所有動(dòng)物組織中幾乎不存在能與抗地高杭體結(jié)合的配體,因而非特異性反應(yīng)很低??沟馗叩奶禺愋钥贵w與脊椎動(dòng)物甾體激素的交叉反應(yīng)不到1%,若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后,則可*排除細(xì)胞Fc受體非特異性的吸附作用。
本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡測(cè)定。
(一)試劑配制
1、磷酸緩沖液PBS(pH7.4):磷酸鈉鹽 50mM,NaCl 200mM。
2、蛋白酶K(200μg/ml,pH7.4):蛋白酶K 0.02g;PBS 100ml。
3、含2%H2O2的PBS緩沖液(pH7.4):H2O2 2.0ml;PBS緩沖液 98.0ml。
4、TdT酶緩沖液(新鮮配):Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調(diào)節(jié)pH至 7.2,加ddH2O定容到1000ml;再加入二甲砷鈉 29.96g和化鈷0.238g。
5、TdT酶反應(yīng)液:TdT酶32μl;TdT酶緩沖液 76μl,混勻,置于冰上備用。
6、洗滌與終止反應(yīng)緩沖液:化鈉 17. 4g;檸檬酸鈉 8.82g;ddH2O 1000ml
7、0.05%二氨基聯(lián)苯(DAB)溶液:DAB 5mg;PBS 10ml,pH7.4, 臨用前過濾后,加過氧化氫至0.02%。
8、0.5%甲基綠(pH4.0):甲基綠0.5g;0.1M乙酸鈉100ml。
9、100%丁醇,100%、95%、90%、80%和70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶液,乙酸,松香水等。
10、過氧化物酶標(biāo)記的抗地高抗體(ONCOR)
人胰腺癌細(xì)胞,AsPC-1細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人胃癌細(xì)胞,MKN-45細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人胃腺癌細(xì)胞,SGC-7901細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞,CFPAC-1細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人食管癌細(xì)胞,EC109細(xì)胞
人食管癌細(xì)胞,NEC細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人結(jié)腸腺癌細(xì)胞,LS 180細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人結(jié)直腸腺癌瘤株,HCT 116細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞,COLO 201細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人結(jié)直腸癌細(xì)胞,DiFi細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人肝癌細(xì)胞,Hep-3B細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人肝腹水腺癌細(xì)胞,SK-HEP-1細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人肝癌細(xì)胞,HHCC細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人肝癌細(xì)胞,HB611細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人胃腺癌細(xì)胞,AGS細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人肝癌細(xì)胞,HuH-7細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞,HCT-8細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞,HT-29細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞,COLO 205細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人十二脂腸腺癌,HuTu-80細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞,HCT 116細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞,LoVo細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人胰腺腺泡上皮癌,HPAC細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)
人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞,SW620細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)含說明書(傳代方法,培養(yǎng)條件,血清,培養(yǎng)基等)