ACP核酸檢測試劑盒說明書

本試劑盒選取一對鸚鵡熱衣原體(ACP)特異性引物和一條特異性熒光探針，應(yīng)用堿裂解法提取DNA，后者在耐熱DNA聚合酶（Taq酶）作用下，配以FQ-Buffer(內(nèi)含Mg2+、Tris-HCl等)、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，通過PCR-熒光探針體外擴增法對鸚鵡熱衣原體(ACP)一段高保守區(qū)域進行擴增，從而達到快速實時定量檢測之目的。

核酸提取液B    4管    500μl/管 ,Taq 酶系    1管    80μl/管 ,ACP–PCR MIX    1管    960μl/管  ,ACP 陽性質(zhì)控品    1管    50μl/管(1×10P7PCopies/ml) 
陰性質(zhì)控品    1管    500μl/管

C-33A細胞，C8166細胞，C918細胞  適用標本：疑似患者痰液或灌洗液及咽試子等和疑似動物(鳥類及牛羊等哺乳類)肺臟、淋巴結(jié)等組織。
標本采集：
痰液：取受檢者深部痰液2-3ml置入5ml離心管，密閉送檢。
灌洗液：取待檢者肺灌洗2-3ml，置于5ml離心管，密閉送檢。
咽試子：受檢者生理鹽水漱口，無菌咽試子粘取深部痰液，置入5ml離心管，密閉送檢。
疑似動物組織：取發(fā)病動物肺臟、淋巴結(jié)等組織1g左右，轉(zhuǎn)至一1.5ml 離心管中，密閉送檢。

使用方法
DNA提取
C-33A細胞，C8166細胞，C918細胞  標本預(yù)處理
痰液或灌洗液：將痰液或灌洗液充分混勻，取0.5ml轉(zhuǎn)至1.5ml干凈離心管，加入等體積4%NaOH，充分混勻，室溫放置10min，13,000rpm離心5分鐘，棄上清，保留沉淀。咽試子：取1ml生理鹽水加入5ml離心管，充分洗滌咽試子，將洗滌液轉(zhuǎn)至1.5ml干凈離心管中，13,000rpm離心5分鐘，棄上清，保留沉淀。組織：取約100mg組織加1ml生理鹽水，研磨成組織勻漿，取50μl勻漿液轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5ml離心管中。
DNA提?。合蛏鲜鰳吮局屑尤?0μl核酸提取液B充分混勻，100℃烈解10min。13,000rpm 離心3min，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。C-33A細胞，C8166細胞，C918細胞 

陰性質(zhì)控品：取50 μl陰性質(zhì)控品加入50μl核酸提取液B，充分震蕩。后100℃裂解10分鐘，然后13,000rpm離心3分鐘，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。
ACP-陽性質(zhì)控品：直接取4μl進行PCR擴增?；虬凑誔CR擴增介紹方法進行定量分析。
PCR擴增
從試劑盒中取出ACP–PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10,000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1管陰性對照+4管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑    ACP–PCR MIX    Taq酶系
用量    24μl    2μl
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10,000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入26μl，向每管中加入處理后樣品(所獲得的DNA樣品)或ACP–陽性定量標準品(使用前用陰性質(zhì)控品梯度稀釋10倍、100倍、1000倍，記為1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml)和陰性質(zhì)控品4μl，10,000rpm瞬時離心30秒。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性控品，陽性定量標準品以及未知標本，并設(shè)置反應(yīng)體積(30μl)、樣品名稱、標記熒光基團種類(報告基團為FAM，淬滅基團為TAMRA)和循環(huán)條件：
ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應(yīng)蓋)，ABI PRISM7300/7500(使用8聯(lián)管)，MJ Opticon(使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器：循環(huán)條件：94→2分鐘，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40個循環(huán)。
LightCycler等使用毛細管的儀器，循環(huán)條件：94→2分鐘，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40個循環(huán)。
3．結(jié)果分析判定
反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值（3~8），stop值（13~18）以及Threshold值，使Std curve 窗口下的標準曲線達到*（correlation數(shù)值介于-0.97~-1之間，correlation數(shù)值等同于∣r∣值），zui后到Reporter窗口下記錄儀器自動分析計算出的未知標本數(shù)值（Qty-Copies/ml）。

1301細胞，22Rv1細胞，293細胞，293Ad5細胞，293 Cells細胞，293T細胞，293T/17細胞，2BS細胞，5637（HTB-9）細胞，6T-CEM細胞，769-P細胞，786-O細胞，95-D細胞，A172細胞，A-204細胞，A2780細胞，A3細胞，A-375細胞，A-427細胞，A-431細胞，A498細胞，A549細胞，A-673細胞，A875 LIFE細胞，AAV-293細胞，ACC-2細胞，ACC-3細胞，ACHN細胞，AE1201細胞，AGS細胞，AN3CA細胞，Anglne細胞，AsPC-1細胞，Bcap-37細胞，BE(2)-M17細胞，BEAS-2B細胞，BEL-7402細胞，BEL-7404細胞，BEL-7405細胞，BeWo細胞，BGC-823細胞，BIU-87細胞，BT-325細胞，BT-474細胞，BT-549細胞，BxPC-3細胞，，Ca Ski細胞，CA46細胞，Caco-2細胞，Caki-1細胞，Calu-3細胞，Calu-6細胞，Caov-3細胞，CCC-ESF-1細胞，CCC-HB-2細胞，CCC-HBE-2細胞，CCC-HEH-細胞，CCC-HEK-1細胞，CCC-HIE-2細胞，CCC-HPE-2細胞，CCC-HPF-1細胞，CCC-HSM-2細胞，CCD-1095Sk細胞，CCRF-CEM細胞，CFPAC-1細胞，CGM1細胞，Chang liver細胞，CNE細胞，CNE-2Z細胞，CNLMG-B5537LC細胞，CNLMG-B5537SKIN細胞

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