質(zhì)粒提不出和得率較低的原因

1 ) 大腸桿菌老化：

請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。

2 ) 質(zhì)?？截悢?shù)低：

由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA 提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體 。

3 ) 菌體中無質(zhì)粒：

有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此，不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落，另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

4 ) 堿裂解不充分：

使用過多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分。

5 ) 吸附柱過載：

不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。

6 ) 質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí))：

洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。

7 ) 乙醇?xì)埩簦?/strong>

漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。

8 ) 洗脫液加入位置不正確：

洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)wan全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。

9 ) 洗脫液不合適：

DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如，洗脫緩沖液EB(10mM Tris•Cl，pH8.5)或水。洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH7.0～8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。