載體構建是分子生物學研究常用的手段之一。通俗地可以描述為將一段目標片段（基因CDS或者用于轉錄的sgRNA）插入環(huán)形DNA里面，并在體內（一般大腸桿菌）高保真復制擴增后用于后續(xù)科研實驗。根據(jù)后續(xù)實驗目的的不同，通常分為四種類型：

擴增目的基因——構建克隆載體；

表達目的基因——構建表達載體；

編輯基因——構建基因編輯載體；

轉染細胞——構建病毒包裝載體。

載體的基本構造

復制起始點：質粒在大腸桿菌中的復制起點，使質粒得以在大腸桿菌中復制，這意味著你插入到質粒中的目標基因可以享受大腸桿菌的高保真復制系統(tǒng)。

抗性基因：帶有這個質粒的大腸桿菌可以在有氨芐霉素抗性的LB平板上生長，形成單克隆，而不帶有這個質粒的菌株會中毒身亡?？梢院唵蔚恼J為，在抗性平板上長出的菌落代表質粒轉化成功。

標簽蛋白：以lacZa及其附屬元件lac promoter為例，是表達beta半乳糖苷酶的元件，

lacZ可以將無色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍，菌落成藍色，lacZ基因中有供目的基因插入的多克隆位點（MSC），如果目基因成功插入，lacZ基因被破壞，無法表達半乳糖苷酶，菌落不能生成藍色物質，故成白色?？梢院唵蔚恼J為，白色菌落代表目標基因成功插入。

多克隆位點：即酶切位點，是質粒上的限制性酶切位點，可供目的基因插入的位點。

熒光標記:含熒光蛋白的標簽如GFP、RFP等，多見于表達載體。

接下來，我們以最/簡單的克隆載體為例，學習下載體構建的具體流程吧！對于構建克隆載體，人們通常采取了多種策略進行克隆，常用的有酶切酶連方法和同源重組方法，這兩個方法主要區(qū)別有三個方面：第一，靶基因片段擴增引物有別于常規(guī)引物設計；第二，載體切割過程中進行單酶切和雙酶切；第三，載體和目的基因片段的連接是基于同源重組或粘性末端互補。

構建克隆載體的流程

1.載體選擇：

根據(jù)所要構建的質粒目的的差異以及載體和目標片段的酶切位點分析結果來選擇載體。

2.引物設計：

酶切酶連方法的引物設計：設計特異性的目的片段擴增引物，引物的長度一般為18-25bp，GC含量控制在40%-60%，上、下游引物之間GC含量不能相差太大，引物中需要加入兩個合適的酶切位點（需要擴增的目的片段上無選擇的酶切位點）及保護性堿基。引物設計不當可能在擴增時生成引物二聚體，給實驗帶來不便。

同源重組方法的引物設計：設計引物時上游引物5’端前面加的是酶切位點及該酶切位點在載體中對應前面的15個堿基載體片段，下游引物5’端前面加的是相同的酶切位點及該酶切位點在載體中對應后面的15個堿基載體片段，如此設計引物是為了保證目的片段插入載體時方向正確，將目標片段擴增出來后以便與載體連接。

3.PCR擴增：

以研究對象的DNA/cDNA為模板，PCR擴增目的基因，在引物兩端分別引入合適的酶切位點，使用1%瓊脂糖凝膠（根據(jù)片段大小選擇不同濃度的瓊脂糖凝膠）電泳檢測和回收回收目的基因DNA條帶。

4.載體和目標片段的限制性酶切：

質粒載體和目的基因PCR產物的進行雙酶切；使用瓊脂糖凝膠（根據(jù)片段大小選擇不同濃度的瓊脂糖凝膠）電泳檢測和回收1%瓊脂糖凝膠電泳分別回收載體片段部分質粒載體酶切大片段和目的基因酶切片段。

5.連接轉化：

使用DNA連接酶進行載體片段部分和目的基因酶切片段質粒酶切回收大片段與目的基因連接的連接，連接反應在16℃反應12 h小時。取10 L連接產物與100 L DH5α感受態(tài)細胞細菌混勻后冰浴30 min，42℃熱激90 s，立即置冰上放置5 min，加入預熱至室溫的700 L LB培養(yǎng)基， 37℃恒溫搖床培養(yǎng)50 min，吸取 200 L的菌液，用移液器混勻后均勻涂布于含100 g/mL Ampicillin抗性的LB平板上（根據(jù)載體上的抗性篩選標記選擇合適的抗性平板，以 Ampicillin抗性為例）， 37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。

6.挑取克隆提質粒驗證：

（1）菌落PCR驗證：挑取5-10個單菌落直接進行PCR驗證。

（2）酶切驗證：PCR驗證陽性的菌落接種于含5 mL，100 μg/mL Ampicillin抗性的LB培養(yǎng)液中，300 rpm，37℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜。收集菌體，使用，對過夜的菌液進行擴增，選擇陽性菌液，用質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒進行酶切驗證。（也可以不進行酶切驗證，直接進測序驗證。）

（3）測序驗證。

其他類型的載體構建后面會陸續(xù)分享，請小伙伴們持續(xù)關注。