質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或者表達的重要媒介，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值，質粒提取是分子生物學最常見的實驗之一。目前質粒提取實驗大多借助試劑盒來完成，那么關于質粒提取的原理，您的了解足夠深入嗎？

目前，質粒提取試劑盒蕞常用的方法是堿裂解法。堿裂解法原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓撲學結構差異來分離的。在強堿環(huán)境下，細菌的細胞壁和細胞膜被破壞，基因組DNA和質粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結構被破壞而發(fā)生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結合在一起。當加入高鹽緩沖液使pH恢復中性時，共價閉合環(huán)狀質粒DNA復性快，而線性的染色體DNA復性緩慢，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物。這樣，通過離心可沉淀大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，再采用吸附柱對質粒進行吸附、去雜質、洗脫，就完成了質粒提取的實驗。

在進行質粒提取實驗室，有時候質粒提取的濃度不高，達不到后續(xù)進行轉化或轉染的實驗要求，那么可能是哪些原因造成的呢？下面一起來看一下質粒提取有哪些影響因素吧！了解它的影響因素，就能夠做出相應的實驗方案調整，從而得到更高濃度的質粒樣本啦！

影響質粒提取的因素：

質粒提取的得率和質量與很多因素有關，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細胞的裂解、質?？截悢?shù)、質粒的穩(wěn)定性、抗生素等。

宿主菌的種類和培養(yǎng)條件

多數(shù)情況下宿主菌為大腸桿菌，而菌株的不同會影響質粒提取的質量。例如，HB101及其衍生菌株（TG1、JM系列）會在裂解時產生大量的糖類，如果沒有*去除，將抑制后續(xù)實驗中的酶活性，影響質粒DNA提取的質量。

由于無質粒的子細胞在無抗生素時復制速度遠大于含質粒的細胞。因此，宿主菌株接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的過程中，務必加入抗生素進行篩選。宿主菌接種到含相應抗生素的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12-16小時，不應超過16小時。超過16小時后，細胞開始裂解，使得質粒的得率降低，也可能導致質粒丟失或質粒變異。

不同質粒間的差異

質粒提取最終的濃度，最重要的影響因素之一就是質?？截悢?shù)。質?？截悢?shù)是指生長在標準的培養(yǎng)基下每個細菌細胞中所含有的質粒DNA分子的數(shù)目，每個細菌中的質粒的拷貝數(shù)主要決定于質粒本身的復制特性。

按照復制機制，可以把質粒分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細菌染色體復制一次時，質粒也復制一次，每個細菌內只含1-2個質粒；另一類是松弛型質粒，當細菌染色體復制停止后仍然能繼續(xù)復制，每一個細菌內一般含20個左右質?？截?，這些質粒的復制是在寄主的松弛控制之下的。高拷貝質粒與低拷貝質粒在相同條件下進行質粒提取，高拷貝質粒濃度會高于低拷貝質粒的濃度。不同拷貝數(shù)的質粒，菌液量的需求不同，對于低拷貝的質粒，要相應增加菌液的量。

在細菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質粒的拷貝數(shù)。因為氯霉素能抑制宿主細胞蛋白質和DNA的合成，但對松弛型質粒的復制沒有影響。由于氯霉素抑制了宿主細胞蛋白質和DNA的合成，從而抑制了染色體的復制，但質粒復制所用的酶半衰期較長，故質粒仍可繼續(xù)復制，這樣既可增加質粒產量，又可降低細胞的數(shù)量，使細菌裂解液的粘度降低而便于操作。氯霉素的使用濃度為20-170ug/ml，使用氯霉素能在一定程度上提高質粒提取的濃度。