相信屏幕前的你，可能被 shRNA 干擾實(shí)驗(yàn)困擾了無(wú)數(shù)個(gè)日日夜夜......
亦或是屢屢想嘗試，卻次次與之失之交臂......
......被困擾的你是跪在哪一步了呢？
......而止步于起點(diǎn)的你又是因?yàn)槭裁茨兀?/p>

今天寫作這篇文章的目的呢，正是為幫助做實(shí)驗(yàn)的你縷清思路。讓在干擾實(shí)驗(yàn)門口「探頭」的你，系統(tǒng)的了解整個(gè)流程，從而讓入門不再只是想象。

下面我要開始放大招了：

（一）shRNA 干擾機(jī)制＆shRNA 設(shè)計(jì)

shRNA（short/ small hairpin RNA）干擾機(jī)制圖解

shRNA 組成：

shRNA 包括兩個(gè)短的反向互補(bǔ)序列，中間由莖環(huán)（loop）序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，隨后連上 5～6 個(gè) T（轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)）

手動(dòng)設(shè)計(jì)，原則：

A. 首先靶位點(diǎn)選擇應(yīng)該避開基因的非編碼區(qū)；

B. 在正義鏈和反義鏈序列上不能出現(xiàn)連續(xù) 3 個(gè)或以上的 T，這可能導(dǎo)致 shRNA 轉(zhuǎn)錄的提前終止；

C. Stratagene 發(fā)現(xiàn) 29 個(gè)寡核苷酸抑制目的基因表達(dá)的效率比 23 個(gè)寡核苷酸的高；

D. 在啟動(dòng)子下游的酶切位點(diǎn)下方緊連一個(gè) C，使插入片段和啟動(dòng)子有一定空間間隔以確保轉(zhuǎn)錄的發(fā)生；

E. shRNA 目的序列的個(gè)堿基必須是 G 以確保 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄。如果選擇的目的序列不以 G 開頭，必須在緊連正義鏈的上游加一個(gè) G；

F. shRNA 插入片段中的莖環(huán)應(yīng)當(dāng)靠近寡核苷酸的中央，比較了眾多不同長(zhǎng)度和序列的莖環(huán)，5'TTCAAGAGA3' 序列zui為有效；

G.  5～6 個(gè) T 必須放置在 shRNA 插入片段尾部以確保 RNA 聚合酶III終止轉(zhuǎn)錄；

shRNA 設(shè)計(jì)好并合成之后，通過(guò)同源重組或者是酶切連接的方法進(jìn)行干擾載體構(gòu)建，構(gòu)建成功后大量抽提質(zhì)粒（去內(nèi)毒素且 OD260/OD280 hao在 1.8 左右），以備轉(zhuǎn)染。