1. 實驗原理：本試劑盒采用競爭法檢測樣本中人Ⅳ型膠原(COL4)的含量。向預(yù)先包被了抗體的酶標(biāo)孔中加入樣本，再加入生wu素標(biāo)記的識別抗原，在37℃下孵育30min，兩者與固相抗體競爭結(jié)合形成免疫復(fù)合物，經(jīng)PBST洗滌除去未結(jié)合的生wu素抗原，然后加入親和素-HRP，在37℃下孵育30min,親和素-HRP與生wu素抗原結(jié)合，洗滌后結(jié)合的HRP催化TMB（四甲基聯(lián)苯胺）成藍色，隨后在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，在450nm波長下有吸收峰，吸光值與樣本中抗原的濃度成負(fù)相關(guān)。

2.試劑盒內(nèi)容及其配制

3.試劑準(zhǔn)備

a.使用前所有試劑應(yīng)置于室溫平衡至少30分鐘。

b.本試劑盒可以直接加樣，如濃度過高，可以進行適當(dāng)比例的稀釋（推薦2-5倍稀釋），計算時應(yīng)將結(jié)果乘以稀釋的倍數(shù)。

c.洗滌液為25倍濃縮液，使用前將所有洗滌液倒入500ml或1L的燒杯中，用雙蒸水定容到500ml即為工作液。

d.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：先用標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉定容到150μl，然后漩渦混勻30秒即為標(biāo)準(zhǔn)品原液（24小時內(nèi)用完）。取5支干凈的Eppendorf管，每管加150μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，分別標(biāo)記上160ng/L,80ng/L,40ng/L,20ng/L  ,10ng/L .取150μl標(biāo)準(zhǔn)品原液加入標(biāo)記160ng/L  的管中，混勻后同樣取出150μl，加入下一管，以此類推直至最后一管。零孔：直接加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液。

e.生wu素抗原的稀釋：抽取生wu素抗原稀釋液1ml到濃縮型生wu素抗原中，漩渦混勻15秒至凍干粉wan全溶解，然后將所有液體移入稀釋液瓶中,再次漩渦混勻30秒即為生wu素抗原工作液。

f.親和素-HRP的稀釋：低速離心（使?jié)饪s液全部沉到管底），將濃縮親和素-HRP全部移入相應(yīng)稀釋液中然后漩渦混勻30秒即為親和素-HRP工作液。

4.洗板方法

a.手工洗板：先洗去酶標(biāo)孔中的的液體，在吸水紙上拍干，然后每孔加入300μl稀釋好的洗滌液，輕輕搖晃30秒，然后甩掉，在吸水紙上拍干，重復(fù)4-5次。

b.洗板機洗板：洗板機洗板比較便捷，但應(yīng)操作熟練后使用。

5.性能參數(shù)：

a.批內(nèi)差：CV＜10%

b.批間差：CV＜12%

c.靈敏度：1ng/L

d.保存：    2-8℃

e.規(guī)格：    96T/盒

f.有效期：  6個月（2-8℃）。

6.詳細操作程序

a.      使用前請先將試劑盒在室溫下平衡半小時。

b.       空白孔不加樣，只加顯色劑A，B和終止液用于調(diào)零。

c.       標(biāo)準(zhǔn)品孔：每孔加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50μl，零孔加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液50μl，然后加入生wu素抗原工作液50μl(零孔必須要做，并將其作為標(biāo)曲的最后一個點)。

d.       樣品孔：加入樣品50μl（推薦直接加樣，濃度高可以用樣品稀釋液稀釋2-5倍），然后加入生wu素抗原工作液50μl。

e.       輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min。

f.        將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水25倍稀釋后備用。

g.       第一次洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

h.       加入50μl親和素-HRP到標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中，輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min。

i.        第二次洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

j.        顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。

k.       終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色).

l.        測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進行。

m.     計算：根據(jù)濃度和OD值算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，建議用專用計算軟件進行計算，推薦使用ELISAcalc進行計算，擬合模型選用logistic曲線