人可溶性粘附分子(Sam)ELISA試劑盒 檢測(cè)原理
人可溶性粘附分子(SAM) ELISA試劑盒是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA），采用雙抗體夾心ELISA法。預(yù)先包被的抗體為可溶性粘附分子(SAM) 單克隆抗體，檢測(cè)相抗體為多克隆抗體，經(jīng)生wu素（biotin）標(biāo)記。樣品和生wu素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，經(jīng)PBS或TBS洗滌，隨后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；經(jīng)過(guò)PBS或TBS的徹di洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測(cè)因子呈正相關(guān)。

試劑盒組成
酶標(biāo)板 、標(biāo)準(zhǔn)品、濃縮生wu素化抗體 、濃縮酶結(jié)合物(ABC)、酶結(jié)合物(ABC)稀釋液 、抗體稀釋液 、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 、樣品稀釋液、濃縮洗滌液(25×) 、顯色劑 A 、顯色劑 B 、終止液

需自備物品
1. 酶標(biāo)儀(450nm檢測(cè)波長(zhǎng)濾光片，570nm或630nm校正波長(zhǎng)濾光片) ；
2. 洗板機(jī)（可調(diào)注液量，保證每孔350μl洗液而不溢出）；
3. 高精度單道加液器（量程為0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl)；
4. 高精度多道加液器（8道或12道，量程為50-300μl)；
5. 37℃恒溫箱；
6. 低溫離心機(jī)；
7. 純凈水或蒸餾水。

標(biāo)本收集注意事項(xiàng)
1. 收集血液的試管應(yīng)為一次性的無(wú)熱原、無(wú)內(nèi)毒素試管；
2. 血清和血漿避免使用溶血、高血脂標(biāo)本；
3. 標(biāo)本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除；
4. 標(biāo)本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，需按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-80℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融；
5. 可根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù)) ；
6. 收集標(biāo)本，盡量做到雙份的用量，避免一次實(shí)驗(yàn)失敗，重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)標(biāo)本缺失，從而耽誤實(shí)驗(yàn)進(jìn)程；
7. 收集標(biāo)本時(shí)，應(yīng)該做好防護(hù)措施（比如戴手套，口罩，護(hù)目鏡等），因?yàn)樗袠?biāo)本都具有一定的潛在危險(xiǎn)性；
8. 樣本處理應(yīng)該在生物安全柜里面，并且正確使用生物安全柜。

標(biāo)本處理
1. 血清：將采集的全血靜置冰箱4℃過(guò)夜，然后1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測(cè)試，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃（3-6個(gè)月）保存；
2.血漿：用EDTA，枸櫞suan鈉，肝素等作為抗凝劑，加入血液混勻后，1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測(cè)試，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃（3-6個(gè)月）保存；
3. 組織勻漿：切取組織塊，0.01M PBS中過(guò)洗一次；按照1G組織加入5-10ml組織蛋白萃取試劑的比例，在冰水中勻漿。勻漿完成后，5000-10000rpm離心10分鐘，取上清立即測(cè)試，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃（3-6個(gè)月）保存；
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測(cè)試，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃（3-6個(gè)月）保存；
5. 尿液，腹水，腦脊液等：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測(cè)試，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃3-6個(gè)月）保存；
注 樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱相關(guān)文獻(xiàn)了解標(biāo)本內(nèi)待測(cè)因子的含量，決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測(cè)因子的濃度處于ELISA試劑盒的最佳檢測(cè)范圍。樣品的稀釋?xiě)?yīng)有詳細(xì)記錄。

注意事項(xiàng)
1．試劑盒使用前請(qǐng)保存在2-8℃。除復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品，其他成分不可凍結(jié)；
2．濃縮生wu素化抗體、濃縮酶結(jié)合物體積小，運(yùn)輸中顛簸和可能的倒置，會(huì)使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請(qǐng)用手甩幾下或1000rpm離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底；
3．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，使結(jié)晶wan全溶解后再配制洗滌液；
4．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，凍干標(biāo)準(zhǔn)品為一次性使用，不得分裝。因其濃度較低，溶解兩小時(shí)候后，會(huì)迅速失活；
5．操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，本試劑不同批號(hào)組分不得混用；
6．配制試劑時(shí)，要用旋渦混合儀混勻。加入孔內(nèi)的試劑，充分混勻?qū)y(cè)試結(jié)果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最di頻率)，如無(wú)微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板1分鐘，例如做圓周動(dòng)作，使加入孔中的反應(yīng)液混勻；
7．實(shí)驗(yàn)用酶標(biāo)儀應(yīng)嚴(yán)格按使用說(shuō)明書(shū)規(guī)范操作，并在使用前充分預(yù)熱；
8．ELISA實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(cè)時(shí)建議作復(fù)孔；
9．應(yīng)將未用的酶標(biāo)板放回原鋁箔袋中，置2-8℃保存；
10．顯色液對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；
11．超過(guò)使用有效日期的試劑盒不能應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中；
12．試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，波長(zhǎng)應(yīng)該設(shè)置為450nm和630nm；
13．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸，使用時(shí)必須注意安全；
14．各步驟加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校準(zhǔn)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣；
15．每次試驗(yàn)測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔最高濃度的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n）；
16．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性；
17．以洗板機(jī)洗板時(shí),每孔注液量不應(yīng)少于350μl, 注意檢查加樣頭是否堵塞。手工洗板時(shí), 用帶紙屑的吸水材料應(yīng)慎重, 防止外源性過(guò)氧化物酶類似物或氧化還原物與顯色劑發(fā)生反應(yīng)；
18．用終止液終止反應(yīng)后，請(qǐng)于10分鐘內(nèi)讀取OD值；
19．進(jìn)行復(fù)孔實(shí)驗(yàn)時(shí)，結(jié)果計(jì)算一定要求平均值；
20．標(biāo)本溶血可能會(huì)有假陽(yáng)性結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)；
21．實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)該將加過(guò)樣品的板條放于密閉盒內(nèi)，并保持濕度約60%左右；
22．為保證恒溫箱內(nèi)的溫度為37℃，恒溫箱的溫度要經(jīng)常校準(zhǔn)。以確保實(shí)驗(yàn)溫度保持恒定；

準(zhǔn)備工作
1. 請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫后方可進(jìn)行試驗(yàn)；
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回 ；
3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.0ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置10分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻，之后在管身標(biāo)注①，然后根據(jù)需要進(jìn)行稀釋注意：務(wù)必要保證凍干標(biāo)準(zhǔn)品徹di溶解和混勻。
4. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法： 取7支潔凈的試劑管，分別標(biāo)注②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧. 每管加入300μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。從第①管內(nèi)取出300μl加入到第②管，混勻后，再?gòu)牡冖诠苋〕?00μl加入到第③管，以此類推至第⑦管。第⑧管為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，作為陰性對(duì)照使用。
5. 生wu素化抗體工作液：按當(dāng)次試驗(yàn)所需用量，用抗體稀釋液稀釋濃縮生wu物素化抗體(1:100)，配置成生wu素化抗體工作液。使用前30分鐘準(zhǔn)備，僅供當(dāng)日使用；
6. 酶結(jié)合物工作液：按當(dāng)次試驗(yàn)所需要用量，用酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1:100)，配置成酶結(jié)合物工作液。使用前30分鐘準(zhǔn)備，僅供當(dāng)日使用；
7. TMB顯色工作液：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液A x 9份加TMB顯色液B x 1份（9：1）的比例配制TMB顯色工作液。

洗滌方法
1. 自動(dòng)洗板機(jī)：要求注入的洗滌液為350μl，注入與吸出間隔20－30秒。確保機(jī)器運(yùn)用熟練后，再投入實(shí)驗(yàn)中使用；
2. 手工洗板：每孔加洗滌液350μl，靜置30秒后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。手工洗板時(shí)，注意加入洗液的過(guò)程中，不要造成孔間污染，從而出現(xiàn)跳孔的現(xiàn)象。

操作步驟
1. 從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條，未用的板條和干燥劑請(qǐng)放回鋁箔袋內(nèi)封存于2-8℃；
2. 預(yù)留空白孔（若使用雙波長(zhǎng)讀板，空白孔可以不設(shè)）；
3. 分別將標(biāo)本或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（0ng/mL孔加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液）加入相應(yīng)孔中(100μl/孔)， 37℃孵箱孵育90分鐘；
4. 提前30分鐘制備生wu素化抗體工作液；
5. 洗板2次；
6. 加入生wu素化抗體工作液(100μl/孔)，37℃孵箱孵育60分鐘；
7. 提前30分鐘制備酶結(jié)合物工作液。室溫避光放置；
8. 洗板3次；
9. 除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(100μl/孔)。37℃孵箱，避光孵育30分鐘；
10. 洗板5次；
11.加入TMB顯色工作液（包括空白孔）100μl/孔，37℃孵箱，避光孵育，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線高濃度的顏色較深，有明顯的顏色梯度的時(shí)候，即可終止。試驗(yàn)顯色反應(yīng)請(qǐng)勿超過(guò)30分鐘；
12.加入終止液（包括空白孔）100μl/孔，混勻后即刻測(cè)量OD（450nm）值(10分鐘內(nèi))。

結(jié)果判斷
1．每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值（若不減零孔值，標(biāo)準(zhǔn)曲線的零孔應(yīng)相交于Y軸）；
2．手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過(guò)標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.3進(jìn)行結(jié)果計(jì)算；
3．若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。